骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療大鼠糖尿病足潰瘍及其VEGF表達(dá)的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：建立一種簡單、穩(wěn)定、便于測量的大鼠糖尿病足潰瘍模型，初步探討局部移植異體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)治療大鼠糖尿病足潰瘍的效果及血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)在全身及局部的表達(dá)情況。
　　 方法：50只雄性Wistar大鼠隨機(jī)分為對照組(10只)和造模組(40只)，造模組大鼠高脂喂養(yǎng)后腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ)45mg/kg，對照組注射等量緩沖液。監(jiān)測兩組空腹血糖、體重、飲水量、尿量及股動脈超聲多普勒血流學(xué)變化。符合血糖≧

2、16mmol/L及多飲、多尿、體重減輕等癥狀后，將兩組大鼠足背部切除一3cm×7cm矩形全層皮膚組織，建立糖尿病足潰瘍模型，比較二組潰瘍愈合時(shí)間。常規(guī)采集MSCs，貼壁法分離、培養(yǎng)、純化大鼠MSCs，取90只雄性Wistar大鼠糖尿病足潰瘍模型，隨機(jī)分為三組，正常對照組(A組，n=30)、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療組(B組，n=30)、糖尿病對照組(C組，n=30)。B、C兩組潰瘍形成后第1天于潰瘍周圍邊緣1cm處四點(diǎn)皮下肉膜層注射移植0

3、.1ml計(jì)數(shù)后細(xì)胞懸液，并同時(shí)于造模后第1、4、8天用軟件Image-Pro Plus6.0記錄三組大鼠的愈合面積、細(xì)胞核熒光染色示蹤、ELISA法檢測外周血VEGF濃度、western-blotting檢測測局部VEGF表達(dá)強(qiáng)度、病理學(xué)觀察及免疫組化檢測CD34表達(dá)。
　　 結(jié)果：1.糖尿病造模組40只注射STZ后，有30只大鼠血糖≧16 mmol/ml，并有多飲、多尿、多食、消瘦等癥狀，一周后行多普勒血流學(xué)檢查，造模組符合動

4、脈粥樣硬化性血流頻譜變化，對照組血流頻譜正常。2.形成潰瘍模型后，造模組平均愈合時(shí)間(12.51±1.21天)明顯較正常大鼠愈合時(shí)間(9.67±0.87天)延遲(P＜0.01)。3.貼壁法體外培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，原代大鼠MSCs第9～10天時(shí)可見培養(yǎng)瓶底有多量散在的梭型、多角型骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，第12天骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可于培養(yǎng)皿底融合80％～90％，傳代后1、2、3代第10天左右可基本融合，第2、3代呈均勻一致的長梭形。4.潰瘍形成第

5、1天注射移植MSCs細(xì)胞于潰瘍周圍，移植后1、4、8天行冰凍切片觀察，均可見淡藍(lán)色熒光聚集生長于潰瘍周圍皮下；5.細(xì)胞移植后平均愈合面積第4天可見B組(潰瘍面積23.62±2.26 mm2)愈合明顯較C組(潰瘍面積25.50±6.79 mm2)快，但仍慢于A組(20.16±3.68 mm2)；第8天檢測A、B、C三組結(jié)果同第4天(潰瘍面積A組3.64±0.92 mm2，B組7.56±1.91 mm2，C組13.20±1.74 mm2)，

6、B組明顯較C組愈合速度快，但仍達(dá)不到A組水平。5.VEGF外周血濃度測定為：第4天(A組1.58±0.06μg/L，B組1.53±0.08μg/L，C組1.04±0.05μg/L，p＜0.01)；第8天(A組1.70±0.04μg/L，B組1.50±0.04μg/L，C組1.14±0.07μg/L，p＜0.01)均可見B組濃度低于正常水平，但高于C組。6.局部VEGF表達(dá)強(qiáng)度：C組(第1天0.21±0.02，第4天0.24±0.02，第

7、8天0.19±0.02)在1、4、8天均明顯低于A(第1天1.04±0.05，第4天1.81±0.06，第8天1.64±0.06)、B組(第1天2.44±0.25，第4天2.86±0.11，第8天0.85±0.06)；B組高于A組；第4天B組顯著高于A組，但第8天，B組低于正常水平A組。7.MSCs移植注射后第1、4、8天檢測CD34+累積光密度(IOD值)可見A組(第1天0.220±0.031，第4天0.279±0.038，第8天0.

8、394±0.102)較B(第1天0.138±0.01，第4天0.189±0.021，第8天0.361±0.032)、C組(第1天0.142±0.042第4天0.173±0.031第8天0.322±0.016)表達(dá)高，第1、4天B、C組無差異，造模第8天，B組較C組表達(dá)高，各組內(nèi)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義8.病理切片觀察可見B組在肉芽生長及表皮覆蓋速度明顯較C組快，但仍然較A組為慢。
　　 結(jié)論：1.通過本實(shí)驗(yàn)建立的動物模型，更加符合糖尿