乙型肝炎病毒X蛋白誘導肝卵圓細胞惡性轉(zhuǎn)化的研究.pdf

1、背景:
　　肝細胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)越來越常見,據(jù)報道其發(fā)病率居惡性腫瘤發(fā)病率的前五,而其致死人數(shù)居每年惡性腫瘤致死人數(shù)的前三。我國是肝細胞癌(以下簡稱肝癌)的高發(fā)地區(qū),而慢性乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)感染經(jīng)流行病學研究證實是我國原發(fā)性肝癌的第一大致病因素。慢性乙型肝炎病毒感染進展為肝硬化,最終進展為肝癌是 HBV相關(guān)原發(fā)性肝癌發(fā)生發(fā)展的常規(guī)過程,但其

2、中的機制研究仍未取得突破性進展。而由HBV X基因編碼的乙型肝炎病毒X蛋白(Hepatitis B virus X protein, HBx)被認為密切地參與了這一過程。HBx是由HBV X基因編碼的多功能蛋白,廣泛參與多種基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控、細胞增殖轉(zhuǎn)化、細胞信號轉(zhuǎn)導等一系列過程。
　　就目前而言,肝癌的具體發(fā)病機制仍未完全明了。普遍來說,肝癌的發(fā)生是一個多因素影響、多機制參與的過程。這些復雜的因素及機制被傳統(tǒng)腫瘤發(fā)生理論歸納為正常肝

3、細胞在各種致癌因素下,正常的生理機制被破壞,發(fā)生異常的轉(zhuǎn)化導致肝癌的發(fā)生。而近些年來新提出的腫瘤干細胞(cancer stem cell, CSC)理論為肝癌的發(fā)生闡釋了另一個角度的可能。簡單而言,腫瘤干細胞理論認為腫瘤由腫瘤干細胞分化而來,而腫瘤干細胞則可能源于各種因素及機制作用下的正常的干細胞異常轉(zhuǎn)化。
　　肝卵圓細胞(hepatic oval cell, HOC)作為一種具有多方向分化潛在能力的肝內(nèi)細胞,被公認為肝干細胞。一

4、系列研究提示肝卵圓細胞(以下簡稱卵圓細胞)可能參與了原發(fā)性肝癌的發(fā)生,在肝癌發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。
　　目的:
　　研究HBx對肝卵圓細胞的轉(zhuǎn)化作用,探討HBx是否能誘導卵圓細胞向肝癌細胞轉(zhuǎn)化。
　　方法:
　　1.構(gòu)建表達HBx和嘌呤霉素抗性基因的慢病毒載體LV-HBx-PM和對應的僅表達嘌呤霉素抗性基因的空慢病毒載體 LV-PM。分別用構(gòu)建好的慢病毒 LV-HBx-PM和LV-PM感染W(wǎng)B-F344卵圓細胞

5、。將感染慢病毒LV-HBx-PM的WB-F344卵圓細胞標記為WB-F344-HBx,設(shè)為實驗組;將感染對照慢病毒LV-PM的WB-F344卵圓細胞標記為 WB-F344-PM,設(shè)為陰性對照組;將未感染病毒并且培養(yǎng)相同代數(shù)的 WB-F344卵圓細胞標記為WB-F344-Mock,設(shè)為空白對照組。經(jīng)篩選培養(yǎng),使用real-time RT-PCR和Western-blot分別在基因和蛋白水平檢測HBx的表達。
　　2.使用流式細胞術(shù)檢

6、測 WB-F344-HBx、WB-F344-PM和 WB-F344-Mock細胞的細胞周期。
　　3.使用MTT法檢測WB-F344-HBx、WB-F344-PM和WB-F344-Mock細胞的增殖能力。
　　4.使用Transwell法檢測WB-F344-HBx、WB-F344-PM和WB-F344-Mock細胞的遷移能力。
　　5.分別將 WB-F344-HBx、WB-F344-PM和 WB-F344-Mock卵圓

7、細胞接種于裸鼠左側(cè)腋窩皮下,每組6只,接種6周后處死裸鼠,觀察各組卵圓細胞成瘤的情況。
　　6.采用 HE染色的方法觀察移植瘤組織情況,用免疫組織化學染色檢測移植瘤組織中HBx和AFP的表達。
　　結(jié)果:
　　1.WB-F344-HBx在基因水平和蛋白水平穩(wěn)定高效表達 HBx;WB-F344-PM和WB-F344-Mock不表達HBx。
　　2.實驗組WB-F344-HBx與陰性對照組WB-F344-PM相比,G

8、0/G1期細胞比例降低[(55.98±0.39)％vs.(63.73±2.02)%,P<0.01],G2/M期細胞比例升高[(15.05±1.67)%vs.(7.41±0.38)%,P<0.01]。陰性對照組WB-F344-PM和空白對照組WB-F344-Mock相比,細胞周期無顯著差異。
　　3.實驗組 WB-F344-HBx與陰性對照組 WB-F344-PM相比,細胞增殖能力增強(P<0.01)。陰性對照組WB-F344-PM

9、和空白對照組WB-F344-Mock相比,細胞增殖能力無顯著差異。
　　4.在細胞遷移實驗中,WB-F344-Mock、WB-F344-PM、WB-F344-HBx細胞均具有細胞遷移能力,透膜細胞數(shù)分別為249.60±17.28個/視野、42.50±14.34個/視野和35.30±10.00個/視野。實驗組WB-F344-HBx與陰性對照組WB-F344-PM相比細胞遷移數(shù)目明顯增多(P<0.01),而陰性對照組 WB-F344-

10、PM與空白對照組 WB-F344-Mock相比細胞遷移數(shù)目無顯著差異。
　　5.接種后6周的飼養(yǎng)過程中,陰性對照組裸鼠死亡1只,其余兩組裸鼠在飼養(yǎng)期內(nèi)無死亡。實驗組裸鼠成瘤(5/6例),腫瘤直徑7±1.9mm,陰性對照組裸鼠成瘤(0/5例),空白對照組裸鼠成瘤(0/6例)。HE染色顯示實驗組移植瘤腫瘤組織呈侵潤性生長。免疫組織化學染色顯示實驗組腫瘤組織 HBx表達陽性,而AFP表達陰性。結(jié)合病理觀察結(jié)果和免疫組織化學染色結(jié)果,排除