CD28分子的克隆表達及CD28核糖體單鏈抗體庫的構建.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、本研究旨在應用核糖體展示技術篩選出與人的CD28分子特異性結合的單鏈抗體,以期CD28單抗能更好的應用于腫瘤的免疫治療。
　　 首先,從Jurkat細胞中得到CD28分子的基因,經(jīng)過酶切連接入表達載體pET28并進行原核表達。
　　 以原核表達純化的重組CD28蛋白抗原免疫Balb/c小鼠,每隔兩周免疫一次,共免疫4次。免疫后,取小鼠脾臟并分離總RNA,設計簡并引物,逆轉錄合成cDNA,PCR擴增小鼠重鏈可變區(qū)VH和輕鏈

2、可變區(qū)κ。通過重疊延伸PCR,經(jīng)linker DNA連接形成抗CD28單鏈抗體庫。
　　 從構建的抗CD28單鏈抗體庫中,應用核糖體展示技術篩選抗CD28的單鏈抗體。所構建的單鏈抗體庫,經(jīng)過體外轉錄翻譯后,形成“單鏈抗體—核糖體-mRNA”三元復合物,并以此進行體外篩選。先以His蛋白負篩,再以CD28為抗原進行篩選。經(jīng)過三輪篩選,RT-PCR擴增單鏈抗體片段,并連接到pET43.1a表達載體中。轉化E.coli DH5a,挑取

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