KCTD15調控小鼠3T3-L1前體脂肪細胞分化的功能與作用機制.pdf

1、研究背景與目的
　　肥胖癥是一種在遺傳和環(huán)境因素共同作用下,導致體內脂肪堆積過多和(或)分布異常,體重增加的慢性代謝性疾病。在人群中進行的全基因組關聯(lián)分析和動物模型水平上的研究,證實 KCTD15(potassium channel tetramerisation domain containing15)基因的變異與肥胖發(fā)生具有緊密相關性。以小鼠3T3-L1前體脂肪細胞為細胞模型的最新研究結果顯示 KCTD15基因在脂肪細胞分化的

2、前期具有重要作用,KCTD15基因敲低能夠抑制3T3-L1前體脂肪細胞分化。但 KCTD15調控肥胖發(fā)生和脂肪細胞分化的潛在作用機制尚不清楚。本課題前期臨床研究顯示 KCTD15基因的 mRNA水平表達在超重、肥胖患者白色脂肪組織中較正常體重患者的白色脂肪組織中明顯降低。因此,本研究以小鼠3T3-L1前體脂肪細胞為細胞模型,綜合運用 RNA干擾技術、表達譜芯片技術和生物信息學分析方法,篩查并鑒定 KCTD15基因敲低前后表達水平受顯著擾

3、動基因。鑒定的潛在靶基因為進一步闡明 KCTD15基因的功能,探討其肥胖相關性的作用機制,尋找新的肥胖癥治療的靶點提供理論依據(jù)。
　　實驗方法
　　1.運用細胞培養(yǎng)技術,培養(yǎng)小鼠3T3-L1前體脂肪細胞。
　　2.運用 RNA干擾技術,在小鼠3T3-L1前體脂肪細胞中特異性敲低 KCTD15基因。
　　3.運用半定量 RT-PCR和 Western-Blot技術檢測敲低前后 KCTD15基因表達水平。
　　

4、4.運用表達譜芯片技術篩查差異表達基因。
　　5.運用生物信息學方法對篩查的差異表達基因進行 GO功能富集分析和 KEGG通路分析。
　　6.運用半定量RT-PCR技術驗證差異表達基因的mRNA表達水平。
　　結果
　　1.運用細胞培養(yǎng)技術,成功的培養(yǎng)了小鼠3T3-L1前體脂肪細胞。
　　2.半定量 RT-PCR和 Western-Blot實驗結果表明,RNA干擾技術成功抑制了KCTD15基因的mRNA水平

5、和總體蛋白水平表達。
　　3.運用表達譜芯片技術,共篩查到386個下調基因和453個上調基因。除去芯片誤差,總共篩查到的差異表達基因有833個。
　　4.差異表達基因的生物信息學分析結果:(1)按生物學過程 GO分析結果顯示:差異表達基因的功能主要富集在生物膜組裝、細胞骨架組裝、染色體組裝、細胞黏附、脂肪細胞分化、蛋白質代謝以及免疫過程上;(2)按照差異基因編碼蛋白的細胞定位 GO分析結果顯示:絕大多數(shù)差異表達基因編碼的蛋白

6、位于細胞骨架和生物膜上;(3)按照差異表達基因的分子功能 GO分析結果顯示:差異表達基因主要富集到細胞骨架的結合、調節(jié)核苷三磷酸酶的活性和酶抑制劑上;(4) KEGG通路分析結果顯示:差異表達基因主要可以富集到二羧酸代謝和半乳糖代謝2條通路中。
　　5.半定量 RT-PCR驗證結果顯示:CUX1基因和 ABCA7基因的表達量升高, MTHFD1基因、MDH1基因和 VPS4B基因的表達量降低,與表達譜芯片測試結果一致。