兔椎間盤退變模型構建及磁性標記ADSC椎間盤內移植的影像學和病理學初步研究.pdf

1、研究背景:
　　 由椎間盤退變(Intervertebral disc degeneration，IDD)引起的下腰痛是人類面臨的重大健康問題之一，下腰痛給患者和社會帶來了沉重的負擔，目前臨床還沒有有效的治療手段。干細胞移植治療IDD有著廣闊的應用前景，將會為臨床治療IDD所引起的下腰痛提供一種新的治療手段，給IDD所引起下腰痛的病人帶來福音。MRI(Magnetic resonance iamging)具有良好的空間分辨率和時

2、間分辨率，能同時獲得解剖及生理信息，可對移植的磁性標記干細胞進行無創(chuàng)、重復的活體、實時、動態(tài)監(jiān)測。
　　 研究目的:
　　 1.探討X線透視引導兔椎間盤穿刺誘導兔椎間盤退變的發(fā)生、發(fā)展規(guī)律及其病理學改變，以及椎間盤穿刺法構建兔IDD模型的可行性和可靠性。
　　 2.探討Gd-DTPA、SPIO標記ADSC椎間盤內移植對退變椎間盤的修復作用。
　　 3.MRI活體監(jiān)測Gd-ADSC、SPIO-ADSC在退變

3、椎間盤內存活、遷移和轉歸，為臨床干細胞移植治療IDD提供理論基礎和活體示蹤、監(jiān)測方法。
　　 材料與方法:
　　 1.兔腰椎IDD模型的制作：
　　 18G穿刺針透視引導下穿刺兔腰椎椎間盤，制作IDD模型，模型制作前、制作后3天(0.5周)、1周、2周、3周、4周、5周、8周、10周行MRI掃描，觀察穿刺后椎間盤的退變過程，并在各時間點取病理行組織學檢查。
　　 2.兔ADSC的原代培養(yǎng)與鑒定：
　

4、　 采用貼壁法對兔ADSC進行分離、培養(yǎng)。對培養(yǎng)的細胞進行CD44、CD90、CD34、CD45等表面抗原鑒定。
　　 3.兔ADSC的體外標記及檢測：
　　 用BrdU、Gd及SPIO對ADSC進行標記，用免疫熒光、MRI掃描、普魯士藍染色檢測標記的可行性，標記后行臺盼藍拒染試驗檢測標記細胞的存活率。
　　 4.兔ADSC的移植及MRI活體示蹤：
　　 取IDD模型制作后2周的兔子，手術暴露L2/3、

5、L3/4、L4/5椎間盤，用微量注射器分別注射25μLPBS、重懸于25μLPBS的BrdU-ADSC(含106個細胞)及重懸于25μLPBS的BrdU+Gd-ADSC或BrdU+SPIO-ADSC(含106個細胞)。ADSC移植前、移植后即刻、3天、1周、2周、3周、4周、6周、8周(分別對應于模型制作后2周、2.1周、2.5周、3周、4周、5周、6周、8周、10周)進行X光照片及MRI掃描。
　　 5.病理學檢查：在MRI掃

6、描各時間點取組織行病理學檢查。
　　 6.統計學分析：使用SPSS16.0統計軟件，P＜0.05認為差異有統計學意義。
　　 結果:
　　 1.ADSC體外標記及檢測：
　　 ADSCBrdU標記后，免疫熒光染色細胞核可見綠色熒光；SPIO標記后，普魯士藍染色細胞漿內可見較多藍染的鐵顆粒，標記的細胞T2WI信號強度及T2值明顯減低；Gd標記后，細胞T1WI上信號明顯增高，T1值減低。標記細胞與未標記細胞臺

7、盼藍拒染率差異無統計學意義。
　　 2.IDD模型：
　　 透視引導下，穿刺針可準確無誤穿刺至椎間盤中心。隨著時間的推移，18G針穿刺的椎間盤逐漸退變，T2WI信號強度逐漸減低，穿刺后2周椎間盤退變迅速，2周后已基本穩(wěn)定，退變緩慢。退變椎間盤T2WI信號強度兩兩比較結果顯示，2周椎間盤T2WI信號強度與1周比較有統計學差異，與3周比較無統計學差異。
　　 3.ADSC移植后MRI活體示蹤：
　　 Gd-A

8、DSC移植后即刻T1WI-SPIR序列上可見椎間盤內高信號，但隨著時間的推移，高信號迅速減低。SPIO-ADSC移植后即刻T2WI-FFE序列上可見椎間盤內明顯低信號，常規(guī)T2WI及T2WI-SPIR序列上亦可顯示椎間盤內低信號，移植標記細胞的椎間盤T2值較未移植細胞及移植未標記細胞的椎間盤明顯減低，SPIO-ADSC移植至椎間盤后10周，仍可檢測到明顯的T2WI-FFE低信號存在。
　　 4.ADSC移植后MRI評價：

9、　　 椎間盤穿刺后0～2周，椎間盤T2WI信號強度迅速減低，模型制作后2周，行移植細胞，SPIO-ADSC組椎間盤自移植后至移植后第8周(即模型制作后10周)，其T2WI信號強度與ADSC組及Gd-ADSC組比較差異均有統計學意義。細胞移植后第1周及第2周(即模型制作后第3周及第4周)，ADSC組及Gd-ADSC組T2WI信號強度與PBS組比較差異有統計學意義。
　　 椎間盤穿刺后0～2周，椎間盤T2弛豫時間迅速減低，SPIO

10、-ADSC組椎間盤自移植后至移植后第8周(即模型制作后10周)，其T2弛豫時間與ADSC組及Gd-ADSC組比較差異均有統計學意義。細胞移植后第3天(即模型制作后第2.5周)，ADSC組及Gd-ADSC組T2弛豫時間與PBS組比較差異有統計學意義。
　　 Gd-ADSC移植至椎間盤后，能通過T1值測量進行監(jiān)測，移植細胞后MRI掃描，Gd-ADSC組T1值明顯減低，Gd-ADSC組椎間盤自移植后至移植后第1周(即模型制作后3周)，

11、其T1弛豫時間與PBS組比較差異有統計學意義。
　　 5.病理學檢查：
　　 正常椎間盤纖維環(huán)、髓核分界清晰，髓核細胞胞漿淡染，纖維環(huán)呈同心圓層狀排列，細胞排列整齊，形態(tài)基本一致，軟骨終板連續(xù)。
　　 IDD模型制作后，椎間盤髓核細胞壞死、崩解，失去正常形態(tài)，纖維環(huán)排列不規(guī)整，出現裂隙及斷裂，纖維環(huán)粘液變性，膠原纖維腫脹、壞死，軟骨終板變薄、凹陷、破裂，后期椎間盤明顯纖維化，軟骨終板多處破裂。
　　 PB

12、S組椎間盤髓核細胞壞死，失去正常形態(tài)，纖維環(huán)排列不規(guī)整，發(fā)生粘液變性，膠原纖維腫脹，出現裂隙及斷裂，注射PBS后8周后椎間盤明顯纖維化，結構紊亂，椎間盤高度明顯減低。
　　 ADSC移植組椎間盤與同時間點PBS組比較，退變程度較輕，髓核及纖維環(huán)內均可見胞漿豐富的軟骨樣細胞。
　　 結論:
　　 1.X線透視引導下18G穿刺針穿刺椎間盤可成功制作逐漸退變、重復性好的兔IDD模型。
　　 2.利用BrdU、G