重組人HIF-1α反義RNA腺相關病毒載體質粒的構建和鑒定.pdf

1、目的：構建重組人HIF-1 α反義RNA腺相關病毒載體(raav-As HIF-1α)，為利用其進行抑制膠質瘤血管再生及治療研究作準備。 方法：從膠質瘤術后凍存標本或U251膠質瘤細胞中提取總RNA，以RT-PCR法反轉錄合成cDNA。設計兩對帶有酶切位點引物進一步擴增出攜帶HIF-1α反義RNA的目的基因片段，酶切后將其在T4連接酶作用下反向與PAAV-Mcs載體連接，再通過分離濃縮和純化重組腺相關病毒載體，獲得較高的病毒滴度

2、。 結果：提取RNA經(jīng)檢驗后，通過RT-PCR獲得HIF-1 α在電泳中可見一條清晰494bp條帶后經(jīng)膠回收得高純度目的基因，將質粒及目的基因經(jīng)過雙酶切后用連接酶連接后轉染入XL10大腸桿菌中過夜可見培養(yǎng)皿中菌落生成，挑克隆經(jīng)腺相關病毒通用引物PCR擴增可見一長約700bp條帶并經(jīng)測序鑒定，獲得的目的基因分子序列包含有HIF-1 α反義RNA，且反向插入PAAV-Mcs載體EcoR I，Xhol部位正確，再通過包裝分離濃縮和純化