松花粉抗下丘腦-垂體-睪丸衰老機理的研究.pdf

1、衰老是隨著年齡增長，組織細胞逐漸退化、器官功能下降引起的不可避免的正常生理現(xiàn)象。隨著醫(yī)學科學的進步和發(fā)展，老齡化國家增多，老齡人口的比率加大，人口的老齡化將成為一個社會問題，提高老年人的生活質量至關重要。1977年Basedovsky提出了“免疫-神經(jīng)-內分泌”網(wǎng)絡學說。1988年Meites提出，在衰老過程中，免疫-神經(jīng)-內分泌網(wǎng)絡起著重要調節(jié)作用，而下丘腦-垂體-性腺軸(HPG)是其重要組成部分，因而研究抗HPG衰老的藥物迫在眉睫。

2、細胞衰老過程是借助于信號傳導途徑實現(xiàn)的，其中Rb和p53控制的信號途徑起重要作用。處于兩個衰老誘導途徑核心位置的是抑癌基因產(chǎn)物Rb、p16INK4a、p53、p19ARF及p21WAF1抑癌蛋白。本研究采用現(xiàn)代細胞生物學和分子生物學技術，從形態(tài)、激素、基因和蛋白等多個層面系統(tǒng)研究松花粉預防和延緩衰老的作用機理，為篩選抗下丘腦-垂體-性腺軸衰老中藥提供實驗依據(jù)。 一、松花粉對D-半乳糖所致衰老大鼠血清抗氧化能力的影響目的觀察松花粉

3、抗D-半乳糖所致亞急性衰老模型大鼠抗氧化能力的影響。 方法1.模型的建立及分組(1)衰老模型的建立：選用清潔級8周齡雄性SD大鼠120只，體重180～220g(由北京大學醫(yī)學部實驗動物科學部提供)。按200mg/kg/d腹腔注射D-半乳糖(用生理鹽水配成5％的溶液)，連續(xù)50d。 (2)實驗分組：根據(jù)實驗目的和要求分組情況如下，正常對照組(10只)；松花粉預防組(中、低劑量組各13只)；將造模成功的大鼠分為模型組(14只

4、)、松花粉延緩衰老組(高、中、低劑量組各14只)、自然恢復組(14只)、VE陽性對照組(14只)。 2.各實驗組大鼠經(jīng)內眥取血2ml，離心取上清，分別用生物化學方法檢測血清SOD、GSH-PX和T-AOC活力以及MDA的含量。 結果大鼠血清抗氧化能力的改變：D-半乳糖所致亞急性衰老模型大鼠SOD活力、GSH-PX活力和T-AOC均明顯下降，MDA含量明顯上升，與正常對照組比較差異顯著(P＜0.01)，自然恢復組與模型組比

5、較無明顯差別(P＞0.05)，而松花粉給藥組SOD活力、GSH-PX活力和T-AOC三者均顯著提高，MDA含量明顯下降，其中松花粉中劑量組效果最好。 結論松花粉可顯著提高D-半乳糖所致亞急性衰老大鼠血清SOD、GSH-PX抗氧化酶活性，從而提高總抗氧化能力，減少血清MDA的堆積。 二、松花粉抗下丘腦、垂體衰老作用的研究目的1.通過檢測各組大鼠下丘腦內GnRH、SP、β-EP的含量，分析松花粉預防和延緩下丘腦衰老的作用機制

6、。 2.通過檢測各組大鼠血清LH、FSH、IGF-Ⅰ含量的變化，探討松花粉抗垂體衰老的作用。 方法1.用放射免疫法檢測各組大鼠血清LH、FSH；用酶聯(lián)免疫法檢測IGF-Ⅰ的含量。 2.大鼠斷頭取下丘腦，采用放射免疫法檢測各組大鼠SP、β-EP和GnRH的含量。 結果1.下丘腦GnRH、SP和β-EP的變化：模型組下丘腦GnRH、SP明顯增高，β-EP明顯降低，與正常組相比有顯著差異(P＜0.01)；模型組

7、與自然恢復組之間比較差異無顯著性(P＞0.05)；松花粉能夠明顯提高β-EP的含量，降低GnRH、SP的濃度，松花粉中劑量組明顯好于其它各組(P＜0.01)。 2.血清促性腺激素和IGF-Ⅰ含量：模型組血清LH、FSH含量明顯升高，IGF-Ⅰ含量明顯下降，與正常組比較差異有顯著性(P＜0.01)；與自然恢復組比較差異無顯著性(P＞0.05)；松花粉能顯著降低衰老大鼠血清LH、FSH含量，提高IGF-Ⅰ濃度(P＜0.01)；其中預

8、防中劑量組效果最為明顯，松花粉組好于VE對照組。 結論松花粉上調下丘腦β-EP的含量，下調GnRH、SP的濃度，降低血清LH、FSH含量，提高IGF-1濃度。因此表明松花粉預防和延緩下丘腦、垂體衰老的作用。 三、探討松花粉預防和延緩睪丸組織衰老的作用目的通過免疫組織化學、原位雜交和放射免疫方法觀察松花粉預防和延緩睪丸組織的衰老作用。 方法1.通過免疫組織化學方法觀察各組大鼠睪丸細胞LHR、EGFR的表達。2.原位

9、雜交方法檢測各組大鼠睪丸細胞IGF-ⅠmRNA的變化情況。3.放射免疫法檢測各實驗組大鼠血清睪酮含量的變化。4.觀察各實驗組大鼠精子數(shù)量、活動度和存活率的變化。 結果1.血清睪酮含量：模型組血清T含量明顯降低，與正常組比較有顯著差異(P＜0.01)；與自然恢復組和高劑量延緩衰老組相比無顯著差異(P＞0.05)；松花粉預防和延緩衰老中、低劑量組能夠顯著提高血清T的含量(P＜0.01)，其作用強于VE對照組。 2.EGFR：

10、在睪丸組織廣泛表達，陽性產(chǎn)物主要分布在睪丸間質細胞、支持細胞、精母細胞和精子細胞的胞漿，呈棕黃色顆?；驁F塊狀。模型組EGFR表達量明顯減少，與正常對照組比較有顯著性(P＜0.01)；與自然恢復組和高劑量延緩衰老組比較無顯著差異(P＞0.05)；而松花粉預防和延緩衰老中、低劑量組均能明顯提高EGFR的表達，強于VE陽性對照組。 3.IGF-Ⅰ基因表達：IGF-ⅠmRNA陽性細胞主要為睪丸間質細胞、支持細胞和肌樣細胞。陽性產(chǎn)物位于胞

11、漿呈彌散的顆粒狀。模型組IGF-ⅠmRNA的表達明顯減少，與正常組比較有顯著差異(P＜0.01)；與自然恢復組和高劑量延緩衰老組比較無顯著差異(P＞0.05)；松花粉中、低劑量組能夠顯著提高IGF-ⅠmRNA的表達，其作用明顯強于VE陽性對照組。 4.LHR：在睪丸間質細胞、精母細胞、精子細胞均有表達，免疫陽性產(chǎn)物分布在細胞漿，呈棕黃色的顆粒或團塊狀。模型組睪丸間質細胞LHR的表達與正常組相比明顯降低(P＜0.01)；模型組與自

12、然恢復組和高劑量延緩衰老組之間無明顯差異(P＞0.05)；松花粉預防和延緩衰老中、低劑量組均能明顯提高睪丸間質細胞LHR的表達，效果明顯強于VE對照組。而模型組睪丸精母細胞、精子細胞LHR的表達比正常組明顯升高(P＜0.01)，模型組與自然恢復組、高劑量延緩衰老組無差異；松花粉預防和延緩衰老中、低劑量組明顯降低生精細胞LHR的表達。 5.精子的活動度、存活率和精子數(shù)量的變化：模型組精子的活動度、存活率和精子的數(shù)量均比正常對照組顯

13、著降低；松花粉預防組和延緩衰老組的中、低劑量組可明顯提高精子的活動度及存活率(P＜0.01)，并能提高精子的數(shù)量(P＜0.05)，與模型組比較均有顯著性差異；VE陽性對照組能夠提高精子的存活率和精子的數(shù)量，與模型組比較有顯著差異，但對精子的活動度影響不明顯；松花粉高劑量延緩衰老組精子的數(shù)量有所提高，但與模型組比較無明顯差異，松花粉高劑量可以提高精子的存活率(P＜0.01)，但抑制精子活動度(P＜0.05)。 結論我們的研究結果表

14、明，松花粉能夠改變睪丸細胞EGFR、LHR、IGF-Ⅰ的表達以及血清T的含量，顯著提高精子的活動度、存活率和精子的數(shù)量，從而改善睪丸生精功能。 四、睪丸細胞衰老通路的研究及松花粉的影響目的通過檢測p53基因及相關蛋白p16、p19、p21在睪丸組織的表達，探討睪丸細胞衰老途徑及松花粉的影響。 方法(1)采用RT-PCR方法檢測p53基因的表達。(2)WesternBlotting檢測大鼠睪丸p16、p19、p21蛋白表達

15、量的變化。 結果1.p53基因的表達：模型組p53基因表達明顯高于正常對照組，與自然恢復組無差異；松花粉預防組和延緩衰老組p53基因的表達明顯降低。 2.p16、p19、p21蛋白含量的變化：模型組睪丸細胞p16、p19、p21蛋白的表達明顯升高，松花粉預防和延緩衰老組睪丸細胞p16、p19、p21蛋白的含量明顯下調。 結論睪丸細胞通過激活Rb/p16和p53/p19/p21兩條途徑而衰老；松花粉通過降低p53、