基于蛋白質-DNA相互作用新型壓電生物傳感器的構建.pdf

1、目的： 1.對白行研制的壓電石英生物傳感器檢測平臺進行改進。 2.用凝膠遷移率實驗(Electrophoreticmobilityshiftassay，EMSA)驗證NF-кB順式元件(DNA)探針與特異性蛋白NF-кB的p65亞基和核蛋白的特異性結合。 3.建立基于蛋白質-DNA相互作用的新型壓電生物傳感器及其影響因素探討，并優(yōu)化出最佳反應條件。 方法： 1.利用精細微加工法制作石英晶體，在其表

2、面光刻金膜電極，石英晶體AT切型、13×13mm、基頻10MHz、金膜電極直徑4.0mm，與檢測池組裝后形成傳感器檢測單元，傳感器檢測單元在檢測儀上構成2×5型拔插式傳感器陣列。頻率記錄分析軟件從PESA-2.0升級到PESA-4.0，新軟件采用VisualC++語言設計，增加多項功能使其更適用于實驗研究和臨床檢測的需要。對構建好的壓電傳感器檢測平臺進行氣液相穩(wěn)定性實驗及陣列檢測穩(wěn)定性實驗。 2.用EMSA驗證NF-кB順式元件

3、(DNA)探針與特異性蛋白NF-кB的結合特異性。 3.將NF-кB順式元件(DNA)探針通過巰基化法固定在傳感器的金膜表面，并與特異性蛋白NF-кB的p65亞基進行結合反應，通過計算機采集分析傳感器頻率數據，比較不同探針濃度、不同pH值、不同離子濃度下頻率的變化，經SPSS軟件進行單因素分析選擇最佳反應條件。 4.以不同濃度p65蛋白為標準品，繪制p65檢測標準曲線，并對核蛋白提取物進行檢測。同時，通過更換不同序列的巰

4、基化探針，探討傳感器檢測的特異性。 結果： 1.AT切型石英晶體液相起振能力強、頻率穩(wěn)定適合壓電生物傳感器檢測要求，傳感器組裝后，氣、液相檢測穩(wěn)定性好，調穩(wěn)后10分鐘內氣相頻率變化不超過±1Hz、液相不超過±2Hz。 2.為了滿足臨床檢測的需要，新編PESA-4.0軟件增加了如病人信息錄入、歷史結果查閱、曲線擬合、定標等多項功能，其中頻率自動更新和圖像編輯等功能的添加對實驗室研究也有較大幫助。 3.EMS

5、A電泳結果顯示標記了同位素的探針與NF-кB的p65亞基和核蛋白提取物的結合較空白對照產生了滯后的電泳條帶，說明了探針和蛋白結合的特異性。樣品空白泳道未加入蛋白固沒有特異性結合條帶。 4.運用構建的壓電石英晶體傳感器檢測p65標準蛋白，探針固定濃度為2.0μmol/L，pH值為7.5，MgCl2離子強度為50mmol/L時結合反應條件最佳。并確定結合反應最終反應時間為15min。 5.壓電生物傳感器對不同濃度p65進行檢

6、測，在10-40ng/μl濃度范圍p65濃度與頻率下降呈線性相關，同時對傳感器的非特異性響應信號進行檢測，非特異性信號響應小，不超過同濃度特異性信號的5％。 結論： 1.構建的壓電石英晶體傳感器檢測系統(tǒng)硬件設計較完善，工作穩(wěn)定，軟件穩(wěn)定易用，功能較完善，整個檢測系統(tǒng)可以應用于檢測和研究。為臨床檢測開發(fā)的PESA-4.0分析軟件對實驗研究也有較大幫助。 2.壓電傳感器檢測取得了較好的結果，檢測時間確定為15min，