變形鏈球菌pacA和gtfB-cat與ctxB嵌合表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及其原核表達(dá).pdf

1、齲病被認(rèn)為是一種細(xì)菌感染性疾病，嚴(yán)重影響著人類健康，其中變形鏈球菌是最主要的致齲菌之一。多年來(lái)，學(xué)者們一直嘗試用免疫學(xué)的方法來(lái)預(yù)防齲病，期望通過主動(dòng)免疫或被動(dòng)免疫來(lái)阻止致齲菌對(duì)宿主口腔的粘附與定殖，從而減少齲齒的發(fā)生。目前，利用轉(zhuǎn)基因植物來(lái)生產(chǎn)疫苗的研究日益深入，轉(zhuǎn)基因植物疫苗能夠通過直接口服的給藥方式誘導(dǎo)動(dòng)物和人體的粘膜和系統(tǒng)免疫應(yīng)答，具有安全、有效、廉價(jià)和方便等優(yōu)點(diǎn)，顯示出較為廣闊的應(yīng)用前景和潛在的經(jīng)濟(jì)效益。 本研究旨在構(gòu)建

2、含變形鏈球菌中富集T、B細(xì)胞表位的表面蛋白氨基端A區(qū)的編碼基因pacA、葡糖基轉(zhuǎn)移酶催化區(qū)的編碼基因gtfB-cat及粘膜免疫佐劑霍亂毒素B亞單位的編碼基因ctxB嵌合表達(dá)質(zhì)粒的轉(zhuǎn)基因植物疫苗，并證實(shí)其在大腸桿菌中正確表達(dá)，為可食嵌合體防齲疫苗的研究打下基礎(chǔ)。 方法：實(shí)驗(yàn)共分兩部分： 第一部分變形鏈球菌pacA和gtfB-cat與ctxB嵌合表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建 1.以質(zhì)粒pcDNA3-pac、pET-gtfB、pBS

3、-ctxB為模板，設(shè)計(jì)合成引物，獲得目的基因pacA、gtfB-cat、ctxB； 2.通過T-A克隆構(gòu)建中間載體T-pacA、T-cat、T-ctxB； 3.T-ctxB及原核克隆載體pET32-a(+)經(jīng)EcoRJ和-ghoⅠ雙酶切后連接，構(gòu)建質(zhì)粒pET-ctxB；T-pacA及pET-ctxB經(jīng)KpnⅠ和BamHⅠ雙酶切后連接，構(gòu)建質(zhì)粒pET-pacA-ctxB；T-cat及pET-pacA-ctxB經(jīng)BamHI和

4、EcoRI雙酶切后連接，構(gòu)建質(zhì)粒pET-pacA-cat-ctxB。 第二部分重組質(zhì)粒pET-pacA-cat-ctxB的原核表達(dá) 將重組質(zhì)粒pET-pacA-cat-ctxB轉(zhuǎn)入表達(dá)宿主菌EcoliBL21(DE3)，通過IPTG化學(xué)誘導(dǎo)的方法表達(dá)目的蛋白。 結(jié)果：構(gòu)建的重組質(zhì)粒pET-pacA-cat-ctxB經(jīng)酶切、PCR鑒定及測(cè)序證實(shí)目的基因pacA、gtfB-cat和ctxB均正確插入到載體pET-32