DADS作用HL-60細胞后對細胞凋亡和周期相關基因表達的影響.pdf

1、第一部分 DADS誘導HL-60細胞增殖抑制和凋亡作用 目的：研究二烯丙基二硫（DADS）對人白血病細胞HL-60的增殖、凋亡及其周期分布的影響。 方法：通過繪制不同濃度DADS作用后HL-60細胞生長曲線和計算細胞群體倍增時間，研究DADS對HL-60細胞增殖抑制作用，并利用流式細胞儀檢測細胞周期分布。采用形態(tài)學觀察、PI單染和Annexin Ⅴ/PI雙染流式細胞術以及DNA瓊脂糖凝膠電泳等方法來證實細胞凋亡。

2、 結果：(1) 生長曲線表明，60μmol·L-1和120μmol·L-1 DADS對HL-60細胞增殖抑制作用明顯。(2) 常規(guī)培養(yǎng)的HL-60細胞群體倍增時間為18.45h，60μmol·L-1和120μmol·L-1DADS作用后細胞群體倍增時間分別延長至30.95h和60.70h。(3) DADS抑制HL-60細胞增殖與周期阻滯有關，15μmol·L-1和30μmol·L-1 DADS主要將HL-60細胞阻滯于S期和G2/M期，

3、60μmol·L-1和120μmol·L-1 DADS主要將HL-60細胞阻滯于G1期。(4) PI單染流式細胞術顯示，15、30、60μmol·L-1 DADS作用HL-60細胞24h后，細胞凋亡率分別為（3.45±0.35）％、（10.90±0.85）％、（33.25±1.63）％，呈濃度依賴性增加。(5) Annexin Ⅴ/PI雙染法顯示，60μmol·L-1 DADS作用4、8、12h后，細胞凋亡率分別為（4.60±0.45）

4、％、（8.51±0.45）％、（16.92±0.77）％，具有明顯的時間依賴性。(6) 60μmol·L-1 DADS作用24h后，DNA瓊脂糖凝膠電泳可見特征性的階梯狀條帶，光學顯微鏡觀察到細胞體積縮小，核濃縮和凋亡小體形成等典型的形態(tài)學改變。 結論： 1.DADS可明顯抑制HL-60細胞增殖，并與細胞周期阻滯有關。 2.60μmol·L-1 DADS能夠有效誘導HL-60細胞凋亡。 第二部分 DA

5、DS作用HL-60細胞后相關基因表達譜分析 目的：應用基因芯片技術獲得DADS作用HL-60細胞后相關基因的表達譜，篩選出差異表達基因。從基因水平探討DADS對HL-60細胞的作用機制。 方法：提取60μmol·L-1DADS作用4h后的HL-60細胞和未處理HL-60細胞中的RNA，反轉錄成cDNA后進行生物素標記，與Superarray公司的含有288個基因的人細胞凋亡和周期基因芯片雜交，GEArray軟件對結果進行

6、分析，篩選出DADS作用后差異表達顯著的基因，并采用RT-PCR和Western blot技術驗證芯片結果可靠性。 結果：(1) 基因芯片檢測發(fā)現(xiàn)，DADS作用后有6個基因表達顯著上調，包括：Fas-L、TRAF1、TRAF5、E2F6、IL8和CXCL10；22個基因表達顯著下調，包括：Bag-1、BNIP3、MCL-1、TNFRSF10C、TNFRSF8、Cyclin B、Cyclin C、Cks1p9、CUL4A、E2F-

7、4、Hus1、MCM2、MKI67、MRE11B、NEDD8、PCNA、SKP1A、GPX1、CAT、DNAJA1、HSPA4和HSPA9B。(2) RT-PCR和Western blot驗證結果表明，60μmol·L-1 DADS作用后Fas-L表達增強，Bag-1表達減弱，與芯片結果一致。 結論： 1.DADS可能通過下調MCM2、MKI67和PCNA抑制HL-60細胞增殖。 2.DADS可能通過下調Cycl