泛耐藥銅綠假單胞菌體外耐藥模型構(gòu)建及其耐藥機制的研究.pdf

1、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa，PA）是院內(nèi)獲得性感染的重要條件致病菌，可以引起嚴重的、甚至致死性的感染如肺炎、泌尿系統(tǒng)感染和血流感染等，而且可造成一定程度的院內(nèi)感染流行。由于廣譜抗生素的廣泛應用，銅綠假單胞菌對超廣譜抗生素的敏感性不斷在下降。多藥耐藥成了銅綠假單胞菌感染的一個嚴重的問題，近年來更是出現(xiàn)了對除了多粘菌素外的所有抗假單胞的抗生素包括青霉素類、頭孢菌素、單酰胺類、氟喹諾酮類、氨基糖苷類和碳青酶烯類

2、等抗菌藥物同時耐藥的菌株，即泛耐藥銅綠假單胞菌（Pandrug-resistant Pseudomonas aeruginosa，PDRPA）。除多粘菌素外目前市面上有售的抗牛素對其完全無效，患者一旦感染，往往使臨床醫(yī)師束手無策，病死率極高，造成極其嚴重的臨床后果。顯然，PDRPA感染已經(jīng)成為臨床醫(yī)師所面臨的日益嚴重且迫切需要解決的課題。 對于泛耐藥銅綠假單胞菌的形成機制，國內(nèi)外學者進行了大量的研究。目前普遍認為，銅綠假單胞菌外

3、膜低通透性和主動外排系統(tǒng)與菌株對部分抗菌藥的固有耐藥有關(guān)，而銅綠假單胞的一個重要特性是獲得性耐藥，這與產(chǎn)生滅活酶、主動外排系統(tǒng)高表達以及生物膜的形成有關(guān)。泛耐藥銅綠假單胞菌的耐藥機制是復雜的，可能是多種耐藥機制的共同作用。但幾乎可以確定的是，泛耐藥銅綠假單胞菌耐藥的形成與抗菌素的應用有明顯的關(guān)系。長期的時間使銅綠假單胞菌暴露于多種抗生素之下是導致PDRPA出現(xiàn)的重要原因。 然而對于深層次的抗菌藥物如何使細菌形成這些耐藥機制，則報

4、道不多。目前知道抗菌藥物應用與銅綠假單胞菌的耐藥關(guān)系緊密。但抗菌藥是如何作用使銅綠假單胞菌產(chǎn)生耐藥？目前有兩種觀點，即：（1）競爭性抑制機制：抗生素應用通過施加選擇性壓力使耐藥細菌增殖增加，體內(nèi)競爭性菌群生長受到抑制。具體到某個患者的個體，選擇性壓力可以使細菌容易出現(xiàn)新的耐藥突變或出現(xiàn)耐藥菌既存的亞群。（2）適應性突變：細菌長時間暴露于抗菌藥物之可以產(chǎn)生自身突變而形成耐藥。國內(nèi)有報道稱以次抑菌濃度環(huán)丙沙星可誘導銅綠假單胞菌對其它喹諾酮類

5、和非同類抗菌素之間的交叉耐藥，次抑菌濃度亞胺培南亦可誘導PA耐藥的發(fā)生。在銅綠假單胞菌耐藥形成過程中，何者占主導地位，目前尚不明確。泛耐藥銅綠假單胞是否也可以通過單純抗菌藥物的誘導而形成呢？目前尚未見報道。如果能夠通過體外誘導的方法使敏感的銅綠假單胞菌株形成泛耐藥菌株，那么對揭示臨床分離的泛耐藥銅綠假單胞菌的形成機制研究無疑具有重要的意義，可以指導臨床銅綠假單胞菌感染的治療。 本研究擬通過體外多種藥物誘導，使敏感的銅綠假單胞菌株

6、轉(zhuǎn)變?yōu)榉耗退幍木辏⑦M一步研究其耐藥機制，從而揭示抗生素應用與泛耐藥銅綠假單胞菌生成的關(guān)系，為臨床銅綠假單胞菌感染的治療提供理論支持。并進一步探討聯(lián)合抗菌藥物體外誘導對銅綠假單胞菌的耐藥性影響，以期對臨床治療有所幫助。 目的: 通過多種抗菌藥物體外誘導構(gòu)建泛耐藥銅綠假單胞菌體外模型，檢測其相關(guān)的耐藥機制；探討聯(lián)合抗菌藥物體外誘導對銅綠假單胞耐藥性的影響。 方法: 1.所有菌株均經(jīng)VITEK-2微生物分析

7、儀鑒定，并用K-B紙片擴散法篩選出對臨床常用六類抗菌藥物包括抗假單胞菌性青霉素類、頭孢菌素、單酰胺類、碳青霉烯類、氟喹諾酮類和氨基糖甙類和多粘菌素B的敏感的銅綠假單胞菌。用標準瓊脂平板二倍稀釋法測定其MIC值。 2.采用梯度濃度瓊脂平皿傳代誘導法，將4株細菌接種在含初始藥物濃度（1/4MIC）的M-H平板上連續(xù)傳代5代后轉(zhuǎn)入高一級濃度（1/2MIC），直至對該藥產(chǎn)生耐藥。然后進入第二種藥物誘導，誘導藥物依次為頭孢他啶→哌拉西林/

8、他唑巴坦→氨曲南→環(huán)丙沙星→亞胺培南/西司他丁→丁胺卡那。誘導前后測定細菌的敏感性。 3.采用E-test法對誘導前的敏感株和誘導的泛耐藥菌株以及臨床分離的泛耐藥菌株進行MBL檢測。 4.采用Real-time PCR技術(shù)對誘導前的4株敏感銅綠假單胞菌和誘導后的4株泛耐藥銅綠假單胞菌以及4株臨床分離的泛耐藥銅綠假單胞菌進行主動外排系統(tǒng)的檢測，包括：MexAB-OprM、MexCD-OprJ、MexEF-OprN和MexX

9、Y-OprM。 5.用亞胺培南、環(huán)丙沙星、阿米卡星和頭孢他啶單用或聯(lián)合用藥的方式，通過多步法誘導7株臨床分離的銅綠假單胞菌敏感株產(chǎn)生耐藥，連續(xù)培養(yǎng)5代。比較單藥和聯(lián)合用藥誘導后各代的MIC值。 結(jié)果: 1.經(jīng)誘導后4株敏感銅綠假單胞菌對六類抗菌藥物的敏感性下降，MIC明顯升高。按照CLSI耐藥折點4株菌株全部轉(zhuǎn)變?yōu)榉耗退幘辍?2.4株臨床分離的敏感銅綠假單胞菌株誘導前后MBL檢測均為陰性；臨床分離的4株

10、泛耐藥銅綠假單胞菌株MBL檢測有2株為陽性，另外2株為陰性。 3.誘導前的4株敏感銅綠假單胞菌，4個外排系統(tǒng)均無高表達；相對于誘導前，經(jīng)過誘導成為泛耐藥菌株之后，4株耐藥誘導株均存在MexA-OprM外排系統(tǒng)高表達，有1株存在MexCD-OprJ和1株MexEF-OprN高表達，全部菌株均無MexXY-OprM高表達；在臨床分離的泛耐藥銅綠假單胞菌中，有1株所有4個主動外排系統(tǒng)均高表達，有1株只有MexAB-OprM高表達，另外

11、三個外排系統(tǒng)無高表達，另外2株4個外排系統(tǒng)均無高表達。 4.單藥誘導48小時后，除含IPM和CIP濃度最高的平皿（4×MIC）中沒有菌落生長，其余平皿均有菌落生長。聯(lián)合用藥誘導后，沒有菌落生的平皿中含藥物的濃度下降。細菌對誘導藥物的MIC迅速升高，聯(lián)合用藥可以使銅綠假單胞菌對所誘導藥物的MIC升高幅度減少，且第一個48小時最為明顯。隨著用藥時間延長，聯(lián)合用藥的優(yōu)勢逐漸下降。 結(jié)論: 1.在體外抗菌藥物的壓力下，敏