益氣養(yǎng)陰活血方治療糖尿病腎病的實(shí)驗(yàn)研究及遠(yuǎn)期療效觀察.pdf

1、研究背景：
　　糖尿病腎病(DN)是糖尿病最常見和主要的慢性微血管并發(fā)癥，早期表現(xiàn)為尿中微量蛋白，繼而出現(xiàn)持續(xù)蛋白尿、水腫、高血壓、腎功能不全，最終發(fā)展至終末期腎病(ESRD)。DN時(shí)，腎小球系膜細(xì)胞是主要的受累細(xì)胞，高血糖作為糖尿病最基本的生化特征，可激活胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK)通路并增加其下游產(chǎn)物前列腺素E2(PGE2)、轉(zhuǎn)化生長因子(TGF-β1)及纖維連接蛋白(FN)的表達(dá)，引起早期腎小球高濾過、細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)合成

2、增多，導(dǎo)致DN的發(fā)生、發(fā)展。目前關(guān)于中藥復(fù)方對DN時(shí)ERK通路的影響多數(shù)是動(dòng)物體內(nèi)試驗(yàn)，體外實(shí)驗(yàn)報(bào)道較少，且多數(shù)側(cè)重在其非血流動(dòng)力學(xué)效應(yīng)。中醫(yī)藥在防治DN方面有較大優(yōu)勢，國內(nèi)關(guān)于中醫(yī)藥治療DN的臨床研究一般療程較短，隨訪超過2年的報(bào)道較少，多數(shù)采用隨機(jī)對照試驗(yàn)，用藥及治療方案單一，臨床推廣性低，且評價(jià)指標(biāo)側(cè)重在實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)及臨床癥狀，缺少對終點(diǎn)事件的評價(jià)。本課題乃中國中醫(yī)科學(xué)院優(yōu)勢病種的后續(xù)研究，益氣養(yǎng)陰活血方是導(dǎo)師治療DN的經(jīng)驗(yàn)方，短期

3、療效觀察可以降低DN患者尿蛋白排泄率，改善生存質(zhì)量，但其作用機(jī)制之前并未做相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究，且缺乏遠(yuǎn)期療效觀察。
　　研究目的：
　　1、實(shí)驗(yàn)研究：探討益氣養(yǎng)陰活血方通過抑制腎小球系膜細(xì)胞的增殖、ERK通路的活化及其下游產(chǎn)物的表達(dá)而治療糖尿病腎病的作用機(jī)制。
　　2、臨床研究：整體評價(jià)以益氣養(yǎng)陰活血方為主的中醫(yī)辨證治療糖尿病腎病的遠(yuǎn)期療效，發(fā)掘中醫(yī)治療本病的特色與優(yōu)勢，為完善中醫(yī)規(guī)范化治療方案和整體療效評價(jià)體系提供參考。<

4、br>　　研究方法：
　　1、實(shí)驗(yàn)研究
　　1.1研究對象：大鼠腎小球系膜細(xì)胞。
　　1.2干預(yù)措施：以高糖作為刺激因素誘導(dǎo)系膜細(xì)胞增殖及ERK通路活化，予益氣養(yǎng)陰活血方和福辛普利含藥血清加以干預(yù)，根據(jù)培養(yǎng)條件不同，將系膜細(xì)胞分為6組：正常血糖組、高糖組、高糖+福辛普利組和高糖+高、中、低濃度中藥組。
　　1.3觀察指標(biāo)：培養(yǎng)6h、12h、24h、48h、72h后，用Western-blot法檢測系膜細(xì)胞磷酸化E

5、RK1/2(pERK1/2)蛋白的表達(dá)，Real time-PCR法檢測系膜細(xì)胞TGF-β1基因的表達(dá)，ELISA法檢測細(xì)胞上清液中PGE2和FN的含量。在培養(yǎng)24h、48h、72h時(shí)，用4-甲偶氮唑藍(lán)(MTT)法檢測系膜細(xì)胞的增殖。
　　2、臨床研究
　　2.1研究對象：2006年12月～2009年12月間在望京醫(yī)院住院或者門診治療的糖尿病腎病患者。
　　2.2干預(yù)措施：以益氣養(yǎng)陰活血方為主的中醫(yī)辨證治療作為暴露因素

6、，將既往病例劃分為兩個(gè)隊(duì)列：(1)中西醫(yī)結(jié)合隊(duì)列(治療組)，接受以益氣養(yǎng)陰活血方為主的中醫(yī)辨證治療+西醫(yī)基礎(chǔ)治療；(2)西醫(yī)隊(duì)列(對照組)，接受單純西醫(yī)基礎(chǔ)治。對兩組病例進(jìn)行回顧性觀察。
　　2.3觀察指標(biāo)：蛋白尿、腎功能進(jìn)展，終末期腎病(ESRD)和死亡各類終點(diǎn)事件；實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)療效、臨床癥狀療效和疾病綜合療效；生存質(zhì)量及營養(yǎng)狀態(tài)評估。
　　研究結(jié)果：
　　1、實(shí)驗(yàn)研究
　　1.1高糖刺激24h、48h后能顯著促

7、進(jìn)系膜細(xì)胞增殖，但至72h，高糖促細(xì)胞增殖趨勢下降，與正常組相比無顯著差異。福辛普利和高濃度中藥含藥血清組均可明顯抑制高糖引起的系膜細(xì)胞增殖，兩組間未見顯著差異。中濃度中藥組僅在24h表現(xiàn)出明顯的抑制作用，低濃度中藥組均未見抑制作用。
　　1.2高糖刺激6h后系膜細(xì)胞中pERK1/2蛋白的表達(dá)即明顯升高，隨時(shí)間延長表達(dá)逐漸增高，24h達(dá)到高峰，后逐漸減弱，至72h恢復(fù)至與正常組同等表達(dá)水平。福辛普利和高濃度中藥組在6h-48h均顯

8、著抑制ERK的活化，兩組在各時(shí)間點(diǎn)均無明顯差異。中濃度中藥組在6h-24h亦表現(xiàn)出明顯的抑制作用。而低濃度中藥組僅在12h可見明顯的抑制作用。
　　1.3與正常組相比較，高糖組TGF-β1mRNA的表達(dá)從12h開始明顯升高，F(xiàn)N的表達(dá)則從24h開始明顯升高，隨著時(shí)間延長，至72h升高趨勢更為顯著。高濃度中藥組在各時(shí)間點(diǎn)均可顯著的抑制TGF-β1mRNA、FN表達(dá)的升高。福辛普利組在早期有明顯抑制作用，中濃度中藥組在后期有明顯抑制作

9、用。低濃度中藥組均未見抑制作用。
　　1.4隨著ERK通路的激活，高糖組PGE2的表達(dá)在6h即明顯升高，48h表達(dá)量達(dá)到峰值，至72h PGE2的表達(dá)較正常組仍有明顯升高，但表達(dá)量較48h有所降低。高濃度中藥組在12-48h可明顯抑制PGE2的升高，中濃度中藥組在24h、48h亦可明顯抑制PGE2的升高。福辛普利組和低濃度中藥組均未見抑制作用。
　　2、臨床研究
　　本研究共納入病例105例，其中治療組67例，對照組3

10、8例，隨訪時(shí)間(從首次納入觀察到末次隨訪)為2-5年，治療組中位隨訪時(shí)間為3.6年，對照組中位隨訪時(shí)間為3.8年。兩組基線資料經(jīng)比較具有可比性。
　　2.1治療組蛋白尿療效總有效率52.9％，對照組總有效率28.6％，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。治療組蛋白尿終點(diǎn)事件的總發(fā)生率為14.9％，對照組總發(fā)生率為34.2％，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。其中治療組早期DN進(jìn)入臨床期DN的發(fā)生率為16.1％，對照組發(fā)生率為47.4％，兩組比較差異

11、有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。治療組尿蛋白程度進(jìn)展的發(fā)生率為13.9％，對照組發(fā)生率為21.1％，兩組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　2.2治療組腎功能療效總有效率62.5％，對照組總有效率20％，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。治療組CKD進(jìn)展的發(fā)生率為14.9％，對照組發(fā)生率為34.2％，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。治療組Scr由正常進(jìn)展至異常的發(fā)生率為3.9％，對照組發(fā)生率為17.9％，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。治療組Scr異常者數(shù)值翻倍或升高≥50％的發(fā)

12、生率為12.5％，對照組發(fā)生率為50％，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　2.3治療組臨床癥狀療效總有效率58.2％，對照組總有效率31.6％，兩組比較差異有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　2.4治療組綜合療效總有效率40.3％，對照組總有效率21.1％，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　2.5治療組ESRD發(fā)生率為3％，對照組發(fā)生率為13.2％；兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　2.6治療組死亡率為7.5％，對照組死亡率為10

13、.5％；兩組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　2.7治療組和對照組普適性生存質(zhì)量及糖尿病特異性生存質(zhì)量積分比較，差異有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　2.8治療組營養(yǎng)不良風(fēng)險(xiǎn)的發(fā)生率為14.9％，對照組發(fā)生率為31.6％，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)論：
　　1、實(shí)驗(yàn)研究：益氣養(yǎng)陰活血方可抑制早期系膜細(xì)胞的增殖、ERK通路的活化及其下游產(chǎn)物PGE2、TGF-β1和FN的表達(dá)升高，對ERK通路所引起的血流動(dòng)力學(xué)效應(yīng)和非血流動(dòng)力學(xué)

14、效應(yīng)均有干預(yù)作用，這可能是其臨床作用機(jī)制所在。
　　2、臨床研究：以益氣養(yǎng)陰活血方為主的中醫(yī)辨證治療能較好地改善臨床癥狀；延緩早期蛋白尿的進(jìn)展；保護(hù)腎臟、延緩腎功能的進(jìn)展及ESRD的進(jìn)程，改善DN的腎臟預(yù)后；提高生存質(zhì)量、改善營養(yǎng)狀況。
　　創(chuàng)新性：
　　1、實(shí)驗(yàn)研究
　　1.1益氣養(yǎng)陰活血方為導(dǎo)師臨床經(jīng)驗(yàn)用方，首次對其作用機(jī)制做相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究。
　　1.2從ERK通路血流動(dòng)力學(xué)和非血流動(dòng)力學(xué)兩方面效應(yīng)探討藥