miR-195在骨肉瘤轉移中的功能及作用機制研究.pdf

1、骨肉瘤是好發(fā)于兒童和青少年的最常見的骨的惡性腫瘤，約40％左右的病例出現的遠隔轉移（主要為肺轉移），是導致治療失敗和死亡的最主要原因，因此尋找新的有效的骨肉瘤的早期診斷工具及治療方法極為迫切。
　　miRNA是一類在真核生物中發(fā)現的非編碼蛋白質的RNA分子，其大小約為22-25nt，可以通過堿基互補配對的方式識別靶基因mRNA，使其直接降解或翻譯抑制，從而達到基因轉錄后調控的作用。研究表明，miRNA參與多種腫瘤轉移的調控，可能起

2、到轉移激活物或抑制物的作用。同時由于其表達具有高度組織特異性、保守性和時序性，miRNA被視為一種新的相對特異的腫瘤轉移生物標志物。miRNA可作為特異性腫瘤轉移生物標志物的特性，同樣為骨肉瘤轉移的診斷和治療提供了新的希望，但是，目前國內外關于骨肉瘤轉移相關性miRNA的研究卻非常有限。
　　本實驗室長期開展骨腫瘤的基礎研究，在自行建立的兩株來自同一母系但具有不同轉移潛能的骨肉瘤細胞系F4和F5M2的基礎上，利用miRNA芯片對其

3、進行表達譜的分析，初步篩選出8個差異表達的miRNA。這些差異表達的miRNA能否成為特異性的骨肉瘤轉移相關性標志物，還有待于進一步的驗證和研究。
　　研究目的：
　　本實驗前期研究基礎上，以在高轉移潛能骨肉瘤細胞系F5M2中呈低表達狀態(tài)的has-miR-195為研究對象，研究其在骨肉瘤轉移中的功能和作用機制，明確其可能作用的靶基因，并探索miR-195及其靶基因作為骨肉瘤轉移相關生物標記物和治療靶點的可能性。
　　研

4、究方法：
　　1.采用TaqMan?探針實時定量PCR分析的方法，對利用miRNA芯片篩選出來的在不同轉移潛能的骨肉瘤細胞系F4和F5M2中差異表達的miR-195進行驗證。
　　2.構建表達miR-195的pSilencer4.1-CMV載體，用其轉染F5M2細胞，并用G418篩選出穩(wěn)定上調miR-195表達水平的骨肉瘤細胞系及其對照組細胞系。
　　3.利用構建的上調miR-195表達水平的骨肉瘤細胞系F5M2+mi

5、R-195，進行miR-195的功能獲得型研究。在體外水平，觀察F5M2+miR-195細胞的增殖、凋亡、遷移及侵襲能力；在裸鼠體內，觀察F5M2+miR-195細胞的原位成瘤能力和肺轉移能力。
　　4.利用三個不同的生物信息學軟件對miR-195進行靶基因的預測分析，并對照不同轉移潛能骨肉瘤細胞系F4和F5M2之間差異表達的47個基因，篩選出miR-195的潛在靶基因，然后分別從基因水平和蛋白水平對其進行驗證。
　　5.收

6、集不同轉移能力的臨床骨肉瘤樣本33例，分別利用實時定量PCR和免疫組織化學染色的方法檢測miR-195和FZD10的表達情況，并分析其表達趨勢與骨肉瘤轉移的相關性。
　　研究結果：
　　1.Real-timeRT-PCR檢測結果顯示miR-195在F4和F5M2中差異表達，并且在F5M2中的表達較F4明顯降低。
　　2.成功構建了miR-195的表達載體pSilencer-miR-195，并篩選出穩(wěn)定上調miR-195

7、表達水平的骨肉瘤細胞系F5M2+miR-195及其對照組細胞系F5M2+NC，Real-timeRT-PCR檢測顯示miR-195在F5M2+miR-195細胞中的表達較對照組明顯升高。
　　3.在體外水平，F5M2+miR-195細胞與F5M2+NC細胞相比，其增殖能力無明顯變化，細胞凋亡略有增加，細胞的遷移及侵襲能力明顯降低；在裸鼠體內，F5M2+miR-195細胞的原位成瘤能力和肺轉移能力均明顯降低。
　　4.生物信息

8、學預測結合靶基因功能分析，篩選出miR-195的一個潛在靶基因FZD10。免疫細胞化學染色及westblotting結果顯示miR-195可以降低骨肉瘤細胞F5M2中FZD10的蛋白表達量，熒光素酶報告檢測系統(tǒng)結果顯示miR-195可以和FZD10的3’UTR的直接結合。
　　5.相比隨訪存活且未發(fā)生轉移組臨床骨肉瘤樣本，隨訪死亡或發(fā)生轉移組中miR-195的相對表達量明顯降低，而FZD10的蛋白表達量明顯增高。
　　研究結

9、論：
　　1.miR-195的表達趨勢與骨肉瘤細胞的轉移潛能呈負相關性，這就提示有必要對miR-195在骨肉瘤轉移中的功能及作用機制做進一步的研究。
　　2.成功構建了穩(wěn)定上調miR-195表達水平的骨肉瘤細胞系F5M2+miR-195及其對照組細胞系F5M2+NC，為進行miRNA在骨肉瘤細胞中的功能獲得型研究提供了前提條件。
　　3.在體外水平，miR-195可以明顯地抑制骨肉瘤細胞F5M2的遷移和侵襲能力，同時具