家畜附紅細胞體體外無細胞培養(yǎng)研究.pdf

1、附紅細胞體（Haemomycoplasmas，HMs）是一類無細胞壁、寄生在多種脊椎動物紅細胞表面的微生物。附紅細胞體引起的疾病即附紅細胞體?。‥perythrozoonosis）簡稱附紅體病，豬的附紅體病臨床上較為多見，對不同年齡段的豬均有危害，現(xiàn)已遍及世界各地，給全球養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。
　　 由于缺乏體外培養(yǎng)系統(tǒng)，HMs研究進展緩慢。早年根據(jù)其部分生物學特性被分類為立克次體（Rickettsiales）。近年來研究

2、發(fā)現(xiàn)HMs在系統(tǒng)進化樹上與霉形體（Mycoplasma）的關系最為接近（76％～83％），且基因組大小（730～770 kb）、堿基組成特點（低G+C％）亦與霉形體類似，因而我們推測附紅細胞體的營養(yǎng)需要、代謝特點可能與霉形體有相似之處，為了更詳細觀察和研究各種動物HMs的菌體形態(tài)、生理生化以及生長繁殖等特性，破解HAMs在體外無細胞培養(yǎng)基中不能人工培養(yǎng)的難題，為HMs的臨床血清學診斷、藥物篩選及疫苗研制等提供理論基礎，我們將豬等各種動物

3、附紅細胞體接種到通過配方篩選的霉形體培養(yǎng)基內(nèi)，傳代時不添加任何陰性紅細胞，而以更換半量培養(yǎng)基的方式進行了體外培養(yǎng)。結(jié)果表明，動物附紅細胞體在體外可長期傳代并持續(xù)存活；皺縮的附紅細胞體經(jīng)培養(yǎng)可以恢復長大；將豬、羊附紅細胞體從紅細胞表面洗脫后亦能按上述方法用霉形體培養(yǎng)基進行連續(xù)傳代并保持存活；但未能獲得附紅細胞體大量增殖的結(jié)果。在此基礎上進行了病原體低溫保存方法研究、抗生素敏感性試驗，主要研究內(nèi)容如下：
　　 1．豬、兔、犬、牛、羊

4、附紅細胞體的體外連續(xù)培養(yǎng)
　　 臨床發(fā)生附紅細胞體病豬血樣，經(jīng)PCR擴增和Giemsa染色鏡檢證明感染豬附紅細胞體（Mycoplasm suis，M． suis）。經(jīng)PCR擴增所得DNA片段，與M． suis已知序列同源性達99％以上。兔、犬、牛、羊血樣若干份，經(jīng)Giemsa染色鏡檢為HM陽性，紅細胞染蟲率（PPE）在50％～95％之間。
　　 經(jīng)預試驗對培養(yǎng)條件優(yōu)化后，將豬、兔、犬、牛、羊等動物的HM陽性紅細胞接種到多

5、種培養(yǎng)基培養(yǎng)內(nèi)，不添加陰性紅細胞，每次傳代更換半量培養(yǎng)基，結(jié)果發(fā)現(xiàn)經(jīng)配方篩選的霉形體培養(yǎng)基PPLO-S-BS（PPLO Broth添加牛血清等成份）培養(yǎng)豬、兔、犬HM效果最佳，連續(xù)維持蟲體（附紅細胞體簡稱，下同）存活分別達280d、300 d、270 d以上，紅細胞染蟲率、染蟲強度保持不變，蟲體飽滿光亮、活力較強；牛HM接種培養(yǎng)基后蟲體皺縮，但經(jīng)PPLO-S-BS等6種培養(yǎng)基培養(yǎng)蟲體長大，并能維持其存活達120-150 d以上；PPLD

6、-S-BS等8種培養(yǎng)基可維持羊HM存活達90～120d以上。
　　 將M． suis、羊HM從紅細胞洗脫后同法用PPLD-S-BS分別培養(yǎng)，培養(yǎng)至90 d、100 d左右后每5～10 d按1：2（v/v）的比例傳代，累計傳代各50次、45次，連續(xù)培養(yǎng)380 d后終止。
　　 通過對M． suis培養(yǎng)物PCR鑒定，對M． suis、兔HM、犬HM培養(yǎng)物的感染陰性紅細胞試驗，對M．suis、犬HM培養(yǎng)物掃描電鏡觀察，對所有培

7、養(yǎng)物的光鏡觀察、抗生素敏感性試驗，證實經(jīng)長期培養(yǎng)的蟲體與接種物為相同病原，所有傳代附紅細胞體一直處于存活并緩慢增殖狀態(tài)。
　　 2．豬、兔、犬、牛、羊附紅細胞體的低溫保存研究
　　 將豬、兔、犬、牛、羊感染HM全血以檸檬酸三鈉抗凝等方法處理后，于4℃保存，結(jié)果發(fā)現(xiàn)檸檬酸三鈉抗凝后直接保存效果最佳，至少3 weeks后紅細胞基本保持完整，染蟲率不變，蟲體存活狀態(tài)良好，保存后皺縮的蟲體經(jīng)培養(yǎng)可以恢復長大。
　　 用改

8、良低濃度甘油冷凍法等3種方法長期低溫凍存豬、兔、犬、牛、羊感染HM的紅細胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)改良低濃度甘油冷凍法凍存上述染蟲紅細胞效果最佳，復蘇后紅細胞存活率最高，PPE不變，HM保持有較好的活性。
　　 3．豬、兔、犬附紅細胞體藥物敏感試驗
　　 有效藥物作用于染蟲紅細胞后，蟲體首先從紅細胞上游離至培養(yǎng)液中，具有明顯的自主運動，后運動減弱，蟲體消失不見。紅細胞染蟲率、染蟲強度不同程度下降，形態(tài)恢復正常，運動特點消失。