貝前列素鈉對(duì)高糖損傷大鼠系膜細(xì)胞的保護(hù)作用及其機(jī)制研究.pdf

1、背景:
　　 糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病(diabetes mellitus，DM)特有的微血管并發(fā)癥之一，其特征性的病理改變包括系膜區(qū)細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)堆積、腎小球硬化及小管間質(zhì)纖維化，最終導(dǎo)致進(jìn)行性尿蛋白/白蛋白排泄的增加和腎功能的下降。DN的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，目前認(rèn)為高血糖、腎血流動(dòng)力學(xué)的異常、晚期糖基化終末產(chǎn)物(advanced glyca

2、tion endproducts，AGEs)的增多、多元醇及蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)途徑的激活、氧化應(yīng)激的產(chǎn)生等多種因素共同參與了DN的發(fā)生與發(fā)展。如何對(duì)糖尿病腎病進(jìn)行有效地防治一直是臨床關(guān)注的熱點(diǎn)與難點(diǎn)。
　　 腎小球系膜細(xì)胞(mesangial cell，MC)是腎小球最重要的固有細(xì)胞之一，對(duì)維持腎小球毛細(xì)血管床的完整性與系膜基質(zhì)代謝平衡起到了重要的作用。在DN的發(fā)病中，各種病理因素直接作用于M

3、C，引起MC肥大與過度增殖，系膜區(qū)膠原纖維(collagen)、纖維連接蛋白（fibronectin，F(xiàn)N）等ECM成分異常的聚集沉積，構(gòu)成了DN腎小球硬化重要的病理基礎(chǔ)。持續(xù)的細(xì)胞外高糖，以及高糖介導(dǎo)的各種病理因素還可以通過腎小球內(nèi)皮細(xì)胞、足細(xì)胞、炎癥細(xì)胞與MC相互作用，產(chǎn)生細(xì)胞因子與炎癥介質(zhì)，通過“自分泌”、“旁分泌”等方式影響MC，介導(dǎo)并促進(jìn)了腎小球纖維化向腎小球硬化的進(jìn)展。
　　 在DN腎小球硬化的病理過程中，轉(zhuǎn)化生長因

4、子β1(transforming growth factorβ1，TGFβ1)是重要的腎臟致纖維化的標(biāo)志之一。MC能夠分泌TGFβ1，并具有高親和力的TGFβ1受體。因而TGFβ1能夠通過“自分泌”、“旁分泌”的方式發(fā)揮其促進(jìn)腎臟纖維化的作用。細(xì)胞外高糖以及高糖介導(dǎo)的各種病理因素均可作為促纖維化因素作用于MC促進(jìn)TGFβ1的合成與分泌，激活TGFβ1下游Smads信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子家族，促進(jìn)ECM的產(chǎn)生并抑制其降解。
　　 除了TGF

5、β1/Smads介導(dǎo)的DN腎纖維化經(jīng)典途徑外，絲裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase，MAPK)通路可以獨(dú)立的或與TGFβ1/Smads通路相互作用，參與DN的發(fā)病。MAPK通路主要包括細(xì)胞外信號(hào)調(diào)控的蛋白激酶(Extracellular signal-regulated kinase mediates,ERK)、c-JunN端激酶(c-junamino-terminal kinase，JN

6、K)/應(yīng)激激活蛋白激酶(stress-activated protein kinase，SAPK)、p38 MAPK等途徑，是細(xì)胞將信號(hào)從細(xì)胞外傳遞到細(xì)胞內(nèi)的主要通路。糖尿病高糖狀態(tài)下，多元醇途徑的激活、蛋白質(zhì)非酶糖化，PKC途徑的激活以及氧化應(yīng)激水平的增加均可導(dǎo)致MAPK的激活，磷酸化下游轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)節(jié)基因的表達(dá)，參與DN的發(fā)生發(fā)展。
　　 糖尿病腎病的病理狀態(tài)下，在MC過度增殖、系膜區(qū)ECM異常增多的同時(shí)，還伴有多種細(xì)胞因子

7、和炎癥介質(zhì)分泌的增加，導(dǎo)致局部炎癥反應(yīng)的激活，加速了腎小球硬化的過程和腎病的進(jìn)展。糖尿病本身是一個(gè)慢性炎癥的過程并由此引起巨噬細(xì)胞在多個(gè)組織中聚集。這種巨噬細(xì)胞的聚集與糖尿病疾病狀態(tài)、炎癥的激活及DN腎損傷的進(jìn)展關(guān)系密切。大量研究表明，單核細(xì)胞趨化蛋白-1(monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1)在糖尿病組織巨噬細(xì)胞浸潤及炎癥中起到了關(guān)鍵作用。
　　 MCP-1是一種能被多種細(xì)胞表達(dá)的，

8、對(duì)單核細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞等具有趨化作用的分泌型蛋白。MCP-1與其受體結(jié)合后，誘導(dǎo)下游黏附分子的表達(dá)，使單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞等向病變部位聚集而發(fā)揮其病理作用。高糖培養(yǎng)系膜細(xì)胞能夠通過PKC與氧化應(yīng)激的激活促進(jìn)MCP-1的表達(dá)。阻斷MCP-1與其受體結(jié)合能減少糖尿病小鼠腎組織巨噬細(xì)胞的浸潤及TGFβ1、IV膠原的表達(dá)，有效地阻止DN腎小球硬化的進(jìn)展。
　　 前列環(huán)素(prostacyclin，PGI2)是前列腺素(prostaglan

9、din，PG)家族中的重要成員，主要由血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生，具有強(qiáng)大的舒張血管平滑肌、擴(kuò)張血管及抗血小板凝聚的作用。體內(nèi)的細(xì)胞膜磷脂被磷脂酶A2水解為花生四烯酸，后者進(jìn)一步在環(huán)氧合酶與前列環(huán)素合成酶的作用下逐步合成PGI2。PGI2合成后通過與兩類受體結(jié)合發(fā)揮其生物學(xué)作用:1）與細(xì)胞膜上G蛋白偶聯(lián)的膜受體IP結(jié)合，主要激活下游的環(huán)磷酸腺苷(cAMP)/蛋白激酶A(protein kinase A，PKA)途徑發(fā)揮舒張血管、抗血小板凝聚及抗纖

10、維化等作用;2）與細(xì)胞核過氧化物酶體增殖激活受體β/δ(peroxisome proliferator-activated receptorβ/δ，PPARβ/δ)結(jié)合，通過PPAR特異的反應(yīng)元件PPRE(PPAR responsive element)調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄。PGI2的性質(zhì)十分不穩(wěn)定，37℃時(shí)半衰期僅4min，很快轉(zhuǎn)化為穩(wěn)定的無活性的代謝產(chǎn)物6-酮-前列腺素。目前主要通過與PGI2有相似藥理作用的人工合成的各種PGI2類似物

11、來研究PGI2的作用機(jī)制。
　　 貝前列素鈉（beraprost sodium，BPS）將PGI2結(jié)構(gòu)中的外烯醇醚結(jié)構(gòu)替換為環(huán)戊烷苯并呋喃酮結(jié)構(gòu)，體內(nèi)半衰期延長至60min，口服途徑給藥仍保留了與PGI2相似的藥理作用。體外研究表明，BPS通過增加系膜細(xì)胞內(nèi)cAMP水平抑制機(jī)械遷張拉力對(duì)MAPK的激活從而抑制FN的表達(dá)，減輕腎小球內(nèi)高壓對(duì)MC的損傷作用;還能夠抑制高糖誘導(dǎo)的MC的增殖、IV膠原的合成并提高M(jìn)C的抗氧化能力。動(dòng)物實(shí)

12、驗(yàn)結(jié)果顯示，BPS喂養(yǎng)OLETF大鼠后，其腎小球體積及硬化指數(shù)明顯低于對(duì)照組，腎小球內(nèi)AGEs的形成及巨噬細(xì)胞浸潤明顯減少，同時(shí)伴有尿蛋白排泄率及血清尿素氮的降低。在STZ誘導(dǎo)的DM大鼠中，BPS通過調(diào)節(jié)入球小動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞一氧化氮合酶活性抑制了DM狀態(tài)下入球小動(dòng)脈的擴(kuò)張，減輕了腎小球的高濾過，同時(shí)還抑制了巨噬細(xì)胞的浸潤。早期的臨床研究發(fā)現(xiàn)，BPS能夠抑制糖尿病患者血清血栓調(diào)節(jié)蛋白水平，通過減輕AngⅡ?qū)Τ銮蛐?dòng)脈的收縮作用、緩解腎小球的

13、高濾過狀態(tài)，降低糖尿病患者尿白蛋白的排泄。這些結(jié)果提示BPS具有一定的腎臟保護(hù)作用。因而，BPS作為一種可以口服的PGI2類似物，在糖尿病腎病的防治中具有廣泛地應(yīng)用前景，進(jìn)一步研究BPS腎臟保護(hù)的作用機(jī)制，具有十分重要的臨床意義。
　　 因此在本研究中，我們探討了PGI2類似物貝前列素鈉(BPS)對(duì)高糖環(huán)境下大鼠系膜細(xì)胞株HBZY-1細(xì)胞ECM合成與降解的作用，對(duì)趨化因子MCP-1表達(dá)的影響，以及對(duì)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路的影響，以闡明貝

14、前列素鈉對(duì)腎臟保護(hù)作用的可能機(jī)制，為貝前列素鈉用于糖尿病腎病的臨床防治提供部分理論依據(jù)。
　　 第一章貝前列素鈉對(duì)高糖環(huán)境下大鼠系膜細(xì)胞ECM合成的影響
　　 目的:
　　 1.觀察不同濃度BPS對(duì)高糖環(huán)境下大鼠細(xì)胞系膜細(xì)胞株HBZY-1增殖活性的影響。
　　 2.觀察不同濃度BPS對(duì)高糖環(huán)境下HBZY-1細(xì)胞TGFβ1、FN及MMP-2蛋白質(zhì)表達(dá)的影響。
　　 3.觀察不同濃度BPS對(duì)高糖環(huán)境下

15、HBZY-1細(xì)胞TGFβ1、FN及MMP-2mRNA水平表達(dá)的影響。
　　 4.探討p38 MAPK、ERK信號(hào)通路是否參與了BPS對(duì)高糖環(huán)境下HBZY-1細(xì)胞ECM合成的調(diào)節(jié)。
　　 5.探討B(tài)PS對(duì)高糖環(huán)境下HBZY-1細(xì)胞TGFβ1/Smad3信號(hào)通路的影響。
　　 方法:
　　 1.細(xì)胞培養(yǎng):采用含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱內(nèi)傳代培養(yǎng)大鼠腎小球系膜細(xì)胞株HBZY-1

16、。
　　 2.細(xì)胞處理分組:正常葡萄糖濃度組(NG組，葡萄糖濃度5.6mmol/L)，高葡萄糖濃度組（HG組，葡萄糖濃度30mmol/L），HG聯(lián)合不同濃度的BPS組:BPS藥物處理濃度分別為0.1umol/L(uM)，0.5 uM，1uM，2uM，5uM,10uM。
　　 3.不同處理組(NG組，HG組，HG分別聯(lián)合不同濃度的BPS組)體外培養(yǎng)HBZY-1細(xì)胞，于24h，48h用MTT法測(cè)定細(xì)胞增殖活性。
　　

17、 4.不同處理組體外培養(yǎng)HBZY-1細(xì)胞，于24h，48h收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，用Elisa法測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)上清液中TGFβ1、FN及MMP-2蛋白質(zhì)的表達(dá)量。
　　 5.不同處理組體外培養(yǎng)HBZY-1細(xì)胞，于24h收集細(xì)胞，用實(shí)時(shí)熒光定量(real-time) PCR法測(cè)定細(xì)胞TGFβ1、FN及MMP-2 mRNA的相對(duì)表達(dá)量(2-△△Ct)。
　　 6.應(yīng)用免疫印跡法分別檢測(cè)0min，15min，30min，60min，

18、90min不同時(shí)間點(diǎn)HG培養(yǎng)條件下HBZY-1細(xì)胞p38 MAPK、ERK磷酸化蛋白的表達(dá)。
　　 7.分別選取HG誘導(dǎo)HBZY-1細(xì)胞p38 MAPK、ERK磷酸化蛋白表達(dá)最顯著的時(shí)間點(diǎn)，應(yīng)用免疫印跡法分別檢測(cè)該時(shí)間點(diǎn)HG聯(lián)合不同濃度BPS培養(yǎng)HBZY-1細(xì)胞p38 MAPK、ERK磷酸化蛋白的表達(dá)。
　　 8.應(yīng)用免疫印跡法分別檢測(cè)0min，15min，30min，60min，90min不同時(shí)間點(diǎn)HG培養(yǎng)條件下HBZ

19、Y-1細(xì)胞smad3磷酸化蛋白的表達(dá)。
　　 9.選取HG誘導(dǎo)HBZY-1細(xì)胞smad3磷酸化蛋白表達(dá)最顯著的時(shí)間點(diǎn)，應(yīng)用免疫印跡法檢測(cè)該時(shí)間點(diǎn)HG聯(lián)合不同濃度BPS培養(yǎng)HBZY-1細(xì)胞smad3磷酸化蛋白的表達(dá)。
　　 10.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，各組計(jì)量資料數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示。采用析因方差分析方法進(jìn)行主效應(yīng)和交互效應(yīng)的分析;多組均數(shù)比較采用單向方差分析(One-w

20、ay ANOVA)，多重比較采用LSD法(Least-significant difference test);方差不齊時(shí)，用Welch法校正，多重比較采用Dunnett's T3法;兩獨(dú)立樣本比較采用t檢驗(yàn)。P≤0.05被認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果:
　　 1.不同濃度BPS對(duì)高糖環(huán)境下HBZY-1細(xì)胞增殖活性的影響:
　　 不同處理組分別培養(yǎng)24h，48h后各組細(xì)胞O.D.值均有顯著差異(24h:F

21、=5.977，P＜0.001;48h:F=25.585，P＜0.001)。與NG組相比，HG組培養(yǎng)24h及48h后HBZY-1細(xì)胞O.D.值均顯著增加（P均＜0.001）。HG聯(lián)合不同濃度BPS培養(yǎng)細(xì)胞24h及48h，與HG組相比，除HG+0.1 uMBPS組外，其余5個(gè)BPS濃度處理組O.D.值均顯著低于HG組(24h: P=0.044;48h: P＜0.001)。
　　 根據(jù)本組實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，選取0.5、1、2、5uM等4個(gè)濃

22、度作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)中BPS的處理濃度。
　　 2.不同濃度BPS對(duì)高糖環(huán)境下HBZY-1細(xì)胞TGFβ1蛋白表達(dá)的影響:
　　 不同處理組分別培養(yǎng)細(xì)胞24h，48h后各組細(xì)胞TGFβ1蛋白表達(dá)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（24h: F=26.441，P＜0.001;48h: F=14.939，P＜0.001）。與NG組相比，HG組分別培養(yǎng)24h及48h后HBZY-1細(xì)胞TGFβ1蛋白表達(dá)量均顯著增加(P＜0.001)。HG聯(lián)合不同濃度B

23、PS培養(yǎng)細(xì)胞24h后，與HG組相比，HG+1uMBPS組、HG+2uMBPS組及HG+5uMBPS組細(xì)胞TGFβ1蛋白表達(dá)量均顯著降低(P=0.001);HG聯(lián)合不同濃度BPS培養(yǎng)細(xì)胞48h后，與HG組相比，各濃度BPS組細(xì)胞TGFβ1蛋白表達(dá)量呈濃度依賴性下降(P=0.011)。
　　 3.不同濃度BPS對(duì)高糖環(huán)境下HBZY-1細(xì)胞FN蛋白表達(dá)的影響:
　　 不同處理組分別培養(yǎng)細(xì)胞24h，48h后各組細(xì)胞FN蛋白表達(dá)量

24、差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（24h: F=5.445，P=0.008;48h: F=10.736，P＜0.001）。與NG組相比，HG組分別培養(yǎng)24h及48h后HBZY-1細(xì)胞FN蛋白表達(dá)量均顯著增加(P=0.001)。HG聯(lián)合不同濃度BPS培養(yǎng)細(xì)胞24h后，與HG組相比， HG+2uMBPS組及HG+5uMBPS組細(xì)胞FN蛋白表達(dá)量均顯著降低（P值分別為0.018，0.007）;HG聯(lián)合不同濃度BPS培養(yǎng)細(xì)胞48h后，與HG組相比，HG+1uM

25、BPS組、HG+2uMBPS組及HG+5uMBPS組細(xì)胞FN蛋白表達(dá)量均顯著降低(P=0.005)。
　　 4.不同濃度BPS對(duì)高糖環(huán)境下HBZY-1細(xì)胞MMP-2蛋白表達(dá)的影響:
　　 不同處理組分別培養(yǎng)細(xì)胞24h，48h后各組細(xì)胞MMP-2蛋白表達(dá)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（24h: F=7.232，P=0.002;48h: F=4.610，P=0.014）。與NG組相比，HG組分別培養(yǎng)HBZY-1細(xì)胞24h及48h后，細(xì)胞

26、MMP-2蛋白表達(dá)量均顯著下降(P=0.001)。HG聯(lián)合不同濃度BPS培養(yǎng)細(xì)胞24h后，與HG組相比，HG+2uMBPS組及HG+5uMBPS組細(xì)胞MMP-2蛋白表達(dá)量顯著增加（P值分別為0.017，0.001）;HG聯(lián)合不同濃度BPS培養(yǎng)細(xì)胞48h后，與HG組相比，HG+2uMBPS組及HG+5uMBPS組細(xì)胞MMP-2蛋白表達(dá)量顯著增加（P值分別為0.019，0.007）。
　　 5.不同濃度BPS對(duì)高糖環(huán)境下HBZY-1

27、細(xì)胞TGFβ1mRNA表達(dá)的影響:
　　 與NG組相比，HG組細(xì)胞TGFβ1 mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯增加（2.45±0.22 vs.1.00±0.00，HG組均數(shù)的95％置信區(qū)間為[1.92，2.99]）。與HG組相比，HG+0.5uMBPS組、HG+1uMBPS組、HG+2uMBPS組及HG+5uMBPS組細(xì)胞TGFβ1 mRNA表達(dá)水平逐漸下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（仁0.008）。
　　 6.不同濃度BPS對(duì)高糖環(huán)境

28、下HBZY-1細(xì)胞FN mRNA表達(dá)的影響:
　　 與NG組相比，HG組細(xì)胞FN mRNA表達(dá)相對(duì)量明顯增加（1.93±0.23 vs.1.00±0.00，HG組均數(shù)的95％置信區(qū)間為[1.36，2.51]）。與HG組相比，HG+2uMBPS組及HG+5uMBPS組細(xì)胞FN mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值分別為0.006，＜0.001）。
　　 7.不同濃度BPS對(duì)高糖環(huán)境下HBZY-1細(xì)胞MMP-

29、2 mRNA表達(dá)的影響:
　　 與NG組相比，HG組細(xì)胞MMP-2 mRNA表達(dá)相對(duì)量顯著下降（0.528±0.132vs.1.000±0.000，HG組均數(shù)的95％置信區(qū)間為[0.199，0.857]）。與HG組相比，HG聯(lián)合不同濃度BPS組細(xì)胞MMP-2 mRNA相對(duì)表達(dá)量有上升趨勢(shì)。但統(tǒng)計(jì)學(xué)分析提示，HG組與HG聯(lián)合不同BPS濃度組，各組細(xì)胞MMP-2mRNA相對(duì)表達(dá)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=0.906，P=0.497)，可

30、能與樣本量偏小，或檢測(cè)MMP-2 mRNA時(shí)間點(diǎn)的選擇有關(guān)。
　　 8.不同時(shí)間點(diǎn)高糖誘導(dǎo)HBZY-1細(xì)胞p38 MAPK磷酸化蛋白的表達(dá):
　　 HG0min組細(xì)胞有少量磷酸化p38 MAPK蛋白表達(dá)，HG刺激15min后細(xì)胞p38MAPK磷酸化蛋白表達(dá)最明顯，刺激30min后p38MAPK磷酸化蛋白的表達(dá)開始減弱，刺激90min磷酸化p38MAPK蛋白信號(hào)仍未消失。
　　 9.不同濃度BPS對(duì)高糖環(huán)境下HBZ

31、Y-1細(xì)胞p38 MAPK蛋白磷酸化的影響:
　　 不同處理組刺激細(xì)胞15min后，HG組HBZY-1細(xì)胞p38 MAPK磷酸化蛋白表達(dá)與NG組相比明顯增多(P＜0.001);與HG組比較，HG聯(lián)合不同濃度的BPS培養(yǎng)細(xì)胞，隨著BPS藥物濃度的增加，細(xì)胞p38 MAPK磷酸化蛋白表達(dá)逐漸減少(P=0.006)。
　　 10.不同時(shí)間點(diǎn)高糖誘導(dǎo)HBZY-1細(xì)胞ERK磷酸化蛋白的表達(dá):
　　 HG0min細(xì)胞有少量磷

32、酸化ERK蛋白表達(dá)，HG刺激15min后細(xì)胞ERK磷酸化蛋白表達(dá)明顯增多，刺激30min后ERK磷酸化蛋白的表達(dá)開始減弱，刺激至90min磷酸化p38MAPK蛋白條帶仍未消失。
　　 11.不同濃度BPS對(duì)高糖環(huán)境中HBZY-1細(xì)胞ERK蛋白磷酸化的影響:
　　 HG刺激15 min后，HG組HBZY-1細(xì)胞ERK磷酸化蛋白表達(dá)比NG組明顯增多(P＜0.001);與HG組比較，HG聯(lián)合不同濃度的BPS培養(yǎng)細(xì)胞，隨著BPS

33、藥物濃度的增加，細(xì)胞ERK磷酸化蛋白表達(dá)水平逐漸減少(P＜0.001)。
　　 12.不同時(shí)間點(diǎn)高糖誘導(dǎo)HBZY-1細(xì)胞Smad3蛋白磷酸化的表達(dá):
　　 HG0min及HG15min組未能檢測(cè)到細(xì)胞Smad3磷酸化蛋白的表達(dá);HG30min組Smad3磷酸化蛋白開始表達(dá)，HG刺激60min時(shí)Smad3磷酸化蛋白表達(dá)最明顯，刺激90min時(shí)明顯減弱。
　　 13.不同濃度BPS對(duì)高糖環(huán)境中HBZY-1細(xì)胞Smad

34、3蛋白磷酸化的影響
　　 HG刺激60min后，HG組HBZY-1細(xì)胞Smad3磷酸化蛋白與NG組比較表達(dá)增多(P=0.007);與HG組相比，HG+2uMBPS組與HG+5uMBPS組細(xì)胞Smad3磷酸化蛋白表達(dá)水平明顯下降（P值分別為0.012，0.004）。
　　 結(jié)論:
　　 1.BPS能夠抑制高糖環(huán)境下HBZY-1細(xì)胞的增殖;
　　 2.BPS能夠抑制高糖環(huán)境下HBZY-1細(xì)胞TGFβ1、FN蛋

35、白質(zhì)的合成及mRNA的表達(dá)，并增加了HBZY-1細(xì)胞MMP-2蛋白質(zhì)的合成;
　　 3.BPS能夠抑制高糖環(huán)境下HBZY-1細(xì)胞p38 MAPK、ERK磷酸化蛋白表達(dá)與Smad3蛋白的磷酸化。BPS可能通過不同信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路間的相互作用，對(duì)高糖環(huán)境下HBZY-1細(xì)胞ECM合成與代謝過程進(jìn)行保護(hù)性的調(diào)控。
　　 第二章貝前列素鈉對(duì)高糖環(huán)境下大鼠系膜細(xì)胞MCP-1表達(dá)的影響
　　 目的:
　　 1.觀察不同濃度

36、BPS對(duì)高糖環(huán)境下HBZY-1細(xì)胞MCP-1蛋白質(zhì)表達(dá)的影響。
　　 2.觀察不同濃度BPS對(duì)高糖環(huán)境下HBZY-1細(xì)胞MCP-1 mRNA表達(dá)的影響。
　　 3.探討NFκB信號(hào)通路是否參與了BPS對(duì)高糖環(huán)境下HBZY-1細(xì)胞MCP-1表達(dá)的調(diào)控。
　　 方法:
　　 1.細(xì)胞培養(yǎng)同第一章
　　 2.細(xì)胞處理分組:
　　 NG組，HG組，HG聯(lián)合不同濃度BPS(0.5uM，1uM，2uM

37、與5uM)組，增加HG+PDTC(1uM)組。
　　 3.不同處理組體外培養(yǎng)HBZY-1細(xì)胞，于24h，48h收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，用Elisa法測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)上清液中MCP-1蛋白質(zhì)的表達(dá)量。
　　 4.不同處理組體外培養(yǎng)HBZY-1細(xì)胞，于24h收集細(xì)胞，用實(shí)時(shí)熒光定量(real-time) PCR法測(cè)定細(xì)胞MCP-1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量(2-△△Ct)。
　　 5.用免疫印跡法分別檢測(cè)0min，15min，3

38、0min，60min，90min不同時(shí)間點(diǎn)HG培養(yǎng)條件下HBZY-1細(xì)胞NFκ B p65亞基核轉(zhuǎn)位的情況。
　　 6.選取HG誘導(dǎo)HBZY-1細(xì)胞NFκB p65亞基核轉(zhuǎn)位最顯著的時(shí)間點(diǎn)，應(yīng)用免疫印跡法檢測(cè)改時(shí)間點(diǎn)HG聯(lián)合不同濃度BPS培養(yǎng)HBZY-1細(xì)胞NFκBp65亞基核轉(zhuǎn)位的變化情況。
　　 7.用細(xì)胞免疫熒光染色法觀察不同處理組NFκB p65亞基核轉(zhuǎn)位的變化。
　　 8.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:同第一章。

39、　　 結(jié)果:
　　 1.不同濃度BPS對(duì)高糖環(huán)境下HBZY-1細(xì)胞MCP-1蛋白表達(dá)的影響:
　　 不同處理組分別培養(yǎng)細(xì)胞24h，48h后各組細(xì)胞MCP-1蛋白表達(dá)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（24h: F=6.973，P=0.001;48h: F=10.436，P＜0.001）。與NG組相比，HG組分別培養(yǎng)24h及48h后HBZY-1細(xì)胞MCP-1蛋白表達(dá)量均顯著增加(P＜0.001)。與HG組比較，HG+PDTC組分別培養(yǎng)細(xì)

40、胞24h、48h后，細(xì)胞MCP-1蛋白表達(dá)量均顯著下降(P＜0.001)。HG聯(lián)合不同濃度BPS培養(yǎng)細(xì)胞24h后，與HG組相比，HG+1uMBPS組、HG+2uMBPS組及HG+5uMBPS組細(xì)胞MCP-1蛋白表達(dá)量顯著降低(P=0.006); HG聯(lián)合不同濃度BPS培養(yǎng)細(xì)胞48h后，與HG組相比， HG+1uMBPS組、HG+2uMBPS組及HG+5uMBPS組細(xì)胞MCP-1蛋白表達(dá)量顯著降低(P=0.003)。
　　 2.不

41、同濃度BPS對(duì)高糖環(huán)境下HBZY-1細(xì)胞MCP-1 mRNA表達(dá)的影響:
　　 與NG組相比，HG組細(xì)胞MCP-1 mRNA表達(dá)相對(duì)量明顯增加（4.62±0.12 vs.1.00±0.00，HG組均數(shù)的95％置信區(qū)間為[4.32，4.93]）。與HG組相比，HG+PDTC組細(xì)胞MCP-1 mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著下降(P＜0.001);HG聯(lián)合不同濃度BPS組細(xì)胞MCP-1 mRNA相對(duì)表達(dá)量較HG組均顯著下降(P=0.011)。

42、
　　 3.不同時(shí)間點(diǎn)高糖誘導(dǎo)的HBZY-1細(xì)胞NFκB p65核轉(zhuǎn)位的變化
　　 HG0min組細(xì)胞核內(nèi)檢測(cè)到少量NFκB p65蛋白的表達(dá)， HG刺激5min后即可檢測(cè)到核內(nèi)NFκB p65蛋白表達(dá)的增加;隨著刺激時(shí)間的延長，核內(nèi)NFκBp65蛋白的表達(dá)量逐漸增加，于刺激90min時(shí)最為明顯，刺激120min時(shí)開始減弱。
　　 胞漿內(nèi)NFκB p65蛋白在HG0min表達(dá)最明顯，HG刺激5min后胞漿內(nèi)NFκ

43、B p65蛋白表達(dá)量開始減少;隨著刺激時(shí)間的延長，胞漿內(nèi)NFκB p65蛋白的表達(dá)逐漸減少，至90min時(shí)表達(dá)量最少。
　　 4.免疫印跡法檢測(cè)不同濃度BPS對(duì)高糖誘導(dǎo)的HBZY-1細(xì)胞NFκB p65核轉(zhuǎn)位的影響
　　 HG刺激90min后，HG組HBZY-1細(xì)胞核內(nèi)NFκB p65蛋白表達(dá)與NG組比較明顯增多。HG聯(lián)合不同濃度的BPS培養(yǎng)細(xì)胞，與HG組相比，HG+1uMBPS組、HG+2uMBPS組與HG+5uMBP

44、S組胞核NFκB p65蛋白表達(dá)逐漸減少(P=0.001)。
　　 HG刺激90min后，HG組HBZY-1細(xì)胞胞漿NFκB p65蛋白表達(dá)較NG組減少。HG聯(lián)合不同濃度的BPS培養(yǎng)細(xì)胞，與HG組相比，HG+2uMBPS組與HG+5uMBPS組胞漿NFκB p65蛋白表達(dá)逐漸增多（P分別為0.049，0.034）。
　　 5.細(xì)胞免疫熒光法觀察BPS對(duì)高糖誘導(dǎo)的HBZY-1細(xì)胞NFκB p65核轉(zhuǎn)位的影響
　　

45、各不同處理組培養(yǎng)細(xì)胞90min后，NG組NFκB p65紅色熒光均顯示于胞漿中，胞核中未見NFB p65紅色熒光。HG組NFκB p65紅色熒光集中于胞核中，胞漿中僅有少量NFκB p65紅色熒光。用PDTC預(yù)先處理細(xì)胞1h抑制NFκB的活化，HG+PDTC組細(xì)胞NFκB p65紅色熒光在胞核中的表達(dá)明顯減少。與HG組比較，HG+2uMBPS組NFκB p65紅色熒光在核內(nèi)顯示明顯減少，在胞漿內(nèi)顯示明顯增多，與HG+PDTC組結(jié)果相似。

46、
　　 結(jié)論:
　　 1.BPS能夠抑制高糖環(huán)境下HBZY-1細(xì)胞MCP-1蛋白質(zhì)的合成及mRNA的表達(dá);
　　 2.BPS能夠抑制高糖環(huán)境下HBZY-1細(xì)胞NFκB p65亞基的核轉(zhuǎn)位，從而抑制了高糖誘導(dǎo)的NFκB的激活，可能參與了BPS對(duì)高糖環(huán)境下HBZY-1細(xì)胞MCP-1表達(dá)的調(diào)控。
　　 第三章PPARβ/δ在貝前列素鈉減輕高糖對(duì)系膜細(xì)胞損傷中的作用
　　 目的:
　　 1.觀察不

47、同濃度BPS對(duì)高糖環(huán)境下HBZY-1細(xì)胞PPARβ/δ蛋白表達(dá)的影響。
　　 2.觀察不同濃度BPS對(duì)高糖環(huán)境下HBZY-1細(xì)胞PPARβ/δ mRNA表達(dá)的影響。
　　 3.觀察選擇性PPARβ/δ受體拮抗劑GSK0660對(duì)高糖環(huán)境下HBZY-1細(xì)胞TGFβ1、FN與MMP-2合成的影響。
　　 4.觀察GSK0660對(duì)高糖環(huán)境下HBZY-1細(xì)胞MAPK信號(hào)通路的影響。
　　 5.觀察GSK0660對(duì)高

48、糖環(huán)境下HBZY-1細(xì)胞MCP-1表達(dá)的影響。
　　 6.觀察GSK0660對(duì)高糖環(huán)境下HBZY-1細(xì)胞NFκB-DNA結(jié)合活性的影響。
　　 方法:
　　 1.細(xì)胞培養(yǎng)同第一、二章。
　　 2.細(xì)胞處理分組:
　　 NG組，HG組，HG+2uMBPS組，HG+GSK0660(5uM)組，HG+2uMBPS+GSK0660(5uM)組，HG+PDTC(1uM)組。
　　 3.不同處理組體外

49、培養(yǎng)HBZY-1細(xì)胞，于24h收集細(xì)胞，用免疫印跡法檢測(cè)細(xì)胞PPAβ/δ蛋白質(zhì)的表達(dá)量。
　　 4.不同處理組體外培養(yǎng)HBZY-1細(xì)胞，于12h收集細(xì)胞，用實(shí)時(shí)熒光定量(real-time) PCR法測(cè)定細(xì)胞PPARβ/δ mRNA的相對(duì)表達(dá)量（2以△Ct）。
　　 5.正式刺激前，提前用GSK0660預(yù)處理細(xì)胞1h拮抗PPARβ/δ受體的作用，然后按上述處理分組繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞24h。
　　 6.收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液

50、用Elisa法測(cè)TGFβ1、FN及MMP-2的蛋白質(zhì)表達(dá)。
　　 7.HBZY-1細(xì)胞p38 MAPK、Erk1/2磷酸化蛋白表達(dá)測(cè)定同第一章。
　　 8.收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液用Elisa法測(cè)MCP-1的蛋白質(zhì)表達(dá)量。
　　 9.應(yīng)用EMSA法檢測(cè)NFκB p65-DNA結(jié)合活性變化。
　　 10.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:同第一、二章。
　　 結(jié)果:
　　 1.不同濃度BPS對(duì)高糖環(huán)境下HBZY-1細(xì)胞

51、PPARβ/δ蛋白表達(dá)的影響
　　 NG組HBZY-1細(xì)胞核內(nèi)存在PPARβ/δ蛋白的表達(dá)。與NG組相比，HG培養(yǎng)24h后胞核PPARβ/δ蛋白表達(dá)量減少(P=0.028)。HG聯(lián)合不同濃度BPS培養(yǎng)細(xì)胞24h后，各組胞核PPARβ/δ蛋白表達(dá)量均較HG組增加(P=0.009)。在不同濃度BPS組中，HG+2uMBPS組PPARβ/δ/Lamin B1蛋白表達(dá)相對(duì)量升高最明顯(P＜0.001 vs.HG+0.5uMBPS);HG

52、+5uMBPS組PPARβ/δ/Lamin B1蛋白表達(dá)相對(duì)量較HG+2uMBPS組下降(P=0.017 vs.HG+2uMBPS)。
　　 2.不同濃度BPS對(duì)高糖環(huán)境下HBZY-1細(xì)胞PPARβ/δ mRNA表達(dá)的影響:
　　 與NG組相比，HG組細(xì)胞PPARβ/δ mRNA表達(dá)相對(duì)量明顯下降（0.69±0.02vs.1.00±0.00，HG組均數(shù)的95％置信區(qū)間為[0.64，0.73]）。與HG組相比，HG聯(lián)合不同

53、濃度BPS組細(xì)胞PPARβ/δ mRNA相對(duì)表達(dá)量均顯著上升(P＜0.001)。在不同濃度BPS組中，HG+2uMBPS組PPARβ/δ mRNA表達(dá)相對(duì)量升高最明顯(P＜0.001 vs.HG+0.5uMBPS); HG+5uMBPS組PPARβ/δ mRNA表達(dá)相對(duì)量較HG+2uMBPS組下降(P＜0.001 vs.HG+2uMBPS)。
　　 3.GSK0660對(duì)高糖環(huán)境下HBZY-1細(xì)胞TGFβ1合成的影響:
　　

54、 不同處理組培養(yǎng)細(xì)胞24h后，各組細(xì)胞TGFβ1蛋白表達(dá)量有顯著差異(F=16.429，P＜0.001)。與NG組相比，HG培養(yǎng)24h后細(xì)胞TGFβ1蛋白表達(dá)量顯著增加(P＜0.001)。與HG組比較，HG+2uMBPS組培養(yǎng)24h后細(xì)胞TGFβ1蛋白表達(dá)量顯著下降(P=0.001)。HG+2uMBPS+GSK0660組細(xì)胞TGFβ1蛋白表達(dá)量與HG+2uMBPS組比較顯著上升(P=0.049);而HG+GSK0660組與HG組比較，

55、兩組細(xì)胞TGFβ1蛋白表達(dá)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.621)。
　　 4.GSK0660對(duì)高糖環(huán)境下HBZY-1細(xì)胞FN合成的影響:
　　 不同處理組培養(yǎng)細(xì)胞24h后，各組細(xì)胞FN蛋白表達(dá)量有顯著差異（F=26.493，P＜0.001）。與NG組相比，HG培養(yǎng)24h后細(xì)胞FN蛋白表達(dá)量顯著增加（P＜0.001）;與HG組比較，HG+2uMBPS組培養(yǎng)24h后細(xì)胞FN蛋白表達(dá)量顯著下降(P=0.001)。HG+2uMBP

56、S+GSK0660組細(xì)胞FN蛋白表達(dá)量與HG+2uMBPS組相比顯著上升(P=0.047);而HG+GSK0660組與HG組比較，兩組FN蛋白表達(dá)量變化不明顯，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.592)。
　　 5.GSK0660對(duì)高糖環(huán)境下HBZY-1細(xì)胞MMP-2合成的影響:
　　 不同處理組培養(yǎng)細(xì)胞24h后，各組細(xì)胞MMP-2蛋白表達(dá)量有顯著差異（F=10.269，P=0.001）。與NG組相比，HG組細(xì)胞MMP-2蛋白表

57、達(dá)量顯著下降(P＜0.001);與HG組比較，HG+2uMBPS組細(xì)胞MMP-2蛋白表達(dá)量顯著上升，(P=0.017)。HG+2uMBPS+GSK0660組細(xì)胞MMP-2蛋白表達(dá)量與HG+2uMBPS組比較變化不明顯，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.956); HG+GSK0660組與HG組比較，兩組細(xì)胞MMP-2蛋白表達(dá)量變化不明顯，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.958)。
　　 6.GSK0660對(duì)HG高糖環(huán)境下HBZY-1細(xì)胞p38

58、 MAPK信號(hào)通路的影響:
　　 HG刺激15min后，與NG組比較，細(xì)胞內(nèi)p38磷酸化蛋白表達(dá)顯著增加(P＜0.001)。HG+2uMBPS組與HG組比較，細(xì)胞內(nèi)磷酸化p38蛋白表達(dá)減少(P＜0.001)。與HG+2uMBPS組比較，HG+2uMBPS+GSK0660組細(xì)胞內(nèi)磷酸化p38蛋白表達(dá)明顯增加(P＜0.001)。HG+GSK0660組與HG組比較，細(xì)胞磷酸化p38蛋白表達(dá)變化不明顯(P=0.061)。
　　

59、7.GSK0660對(duì)HG高糖環(huán)境下HBZY-1細(xì)胞ERK信號(hào)通路的影響:
　　 HG刺激15min后細(xì)胞內(nèi)ERK磷酸化蛋白表達(dá)較NG組顯著增加(P＜0.001)。與HG組比較，HG+2uMBPS組細(xì)胞內(nèi)ERK磷酸化蛋白表達(dá)明顯下降(P＜0.001)。HG+2uMBPS+GSK0660組細(xì)胞內(nèi)ERK磷酸化蛋白表達(dá)較HG+2uMBPS組有所增加(P＜0.001)。HG+GSK0660組與HG組比較，細(xì)胞內(nèi)磷酸化ERK蛋白表達(dá)水平無明

60、顯變化(P=0.093)。
　　 8.GSK0660對(duì)高糖環(huán)境下HBZY-1細(xì)胞MCP-1合成的影響:
　　 不同處理組培養(yǎng)細(xì)胞24h后，各組細(xì)胞MCP-1蛋白表達(dá)量有顯著差異(F=11.402，P=0.001)。與NG組相比，HG組細(xì)胞MCP-1蛋白表達(dá)量顯著增加(P＜0.001)。與HG組比較，HG+2uMBPS組細(xì)胞MCP-1蛋白表達(dá)量顯著下降(P=0.004)。HG+2uMBPS+GSK0660組MCP-1蛋白表

61、達(dá)量與HG+2uMBPS組相比顯著上升(P=0.042);而HG+GSK0660組與HG組比較，兩組MCP-1蛋白表達(dá)量變化不明顯，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.847)。
　　 9.GSK0660對(duì)高糖環(huán)境下HBZY-1細(xì)胞NFκB p65-DNA結(jié)合活性的影響:
　　 NG組未見NFκB-DNA的結(jié)合條帶，HG組可見明顯的NFκB-DNA結(jié)合條帶，說明HG導(dǎo)致NFκB的激活，并且促進(jìn)了NFκB與DNA的結(jié)合。用PDTC預(yù)

62、處理細(xì)胞后，HG+PDTC組NFκB-DNA結(jié)合條帶比HG組明顯減弱，HG+GSK0660組NFκB-DNA結(jié)合條帶與HG組比較變化不明顯，提示GSK0660拮抗RRARβ/δ受體的作用后對(duì)HG導(dǎo)致的NFκB的激活沒有影響。
　　 HG+2uMBPS組的NFκ B-DNA結(jié)合條帶比HG組明顯減弱，與HG+PDTC組的結(jié)果相似，說明2uM BPS能夠抑制HG誘導(dǎo)的NFκB與DNA的結(jié)合。HG+2uMBPS+GSK0660組的NFκ

63、B-DNA結(jié)合條帶比HG+2uMBPS組有所增強(qiáng)，提示BPS能夠通過與RRARβ/δ受體作用，抑制HG誘導(dǎo)的NFκB與DNA的結(jié)合。
　　 結(jié)論:
　　 1.BPS能夠上調(diào)高糖環(huán)境下HBZY-1細(xì)胞PPARβ/δ蛋白與mRNA的表達(dá);
　　 2.GSK0660能夠逆轉(zhuǎn)BPS對(duì)高糖環(huán)境下HBZY-1細(xì)胞TGFβ1、FN合成的抑制作用;而對(duì)BPS增加細(xì)胞MMP-2的合成沒有影響，提示BPS能夠通過與PPARβ/δ受體

64、結(jié)合，調(diào)節(jié)高糖環(huán)境下HBZY-1細(xì)胞TGFβ1、FN的合成;而BPS對(duì)細(xì)胞MMP-2的合成調(diào)節(jié)作用可能不通過PPARβ/δ受體途徑;
　　 3.GSK0660能夠拮抗BPS對(duì)高糖環(huán)境下HBZY-1細(xì)胞內(nèi)p38 MAPK、ERK蛋白磷酸化的抑制作用;提示BPS可以通過與PPARβ/δ受體結(jié)合，抑制HG誘導(dǎo)的p38 MAPK與ERK的激活;
　　 4.GSK0660能夠逆轉(zhuǎn)BPS對(duì)高糖環(huán)境下HBZY-1細(xì)胞MCP-1合成的抑