抵抗素對血管內皮功能的作用及不同干預方法保護內皮功能的實驗研究.pdf

1、研究背景及目的 動脈粥樣硬化(Atherosclerosis，AS)是嚴重威脅人類健康和生命的心血管疾病。目前被普遍接受的Ross“損傷反應”學說認為，血管內皮功能障礙(endothelial dysfuction，ED)是動脈粥樣硬化形成的早期始動環(huán)節(jié)，并且貫穿于動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展的全過程。研究證實，內皮功能障礙的程度還是預測急性心血管事件的重要標志。因此早期檢測內皮功能障礙的危險因子及其引發(fā)內皮功能障礙的可能機制，對于預防

2、動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展有重要意義。 研究方法： 1、外源性高抵抗素血癥模型建立，觀察外源性高抵抗素對血管內皮功能的影響。4周齡SD大鼠16只，隨機分為抵抗素(RE)組與生理鹽水對照(NS)組，各8只。抵抗素組大鼠在禁食10小時后給予尾靜脈注入重組大鼠抵抗素(Phoenix Pharmaceuticals Ltd，美國)10μg，2小時后第二次給予10μg抵抗素，作為短期高抵抗素血癥模型。生理鹽水對照組在相同時間給予等容量

3、生理鹽水尾靜脈注射。于第二次注藥2小時后腹腔麻醉，留取血液及組織標本。比較兩組抵抗素、胰島素、血管內皮分泌因子、血脂等血液指標以及主動脈內皮eNOS、ET、PI3K、AKT表達差異。 2、內源性高抵抗素血癥模型建立，觀察內源性高抵抗素對血管內皮功能的影響。4周齡SD大鼠130只，隨機分為高脂組122只，正常對照組(NC組)8只。高脂組大鼠飼高脂飼料，正常對照組飼基礎飼料。高脂組給予高脂飼料飼養(yǎng)8周后，高脂組與正常對照組大鼠空腹頸

4、靜脈采血，測血清抵抗素水平。①高脂組中血清抵抗素大于正常對照組-X+2s的大鼠共52只，從中隨機選取大鼠40只并分為飲食誘導高抵抗素血癥組(HRE組，n=8)及其他四種干預組(32只，詳見研究方法3)。②高脂組中血清抵抗素低于正常對照組X+s的大鼠共24只，從中隨機選取8只作為高脂飲食正常抵抗素組(NRE組，n=8)。將篩選出的高抵抗素血癥組(HRE組)、正常抵抗素組(NRE組)與正常對照組(NC組)各自按原喂養(yǎng)方法繼續(xù)喂養(yǎng)8周。8周后

5、禁食麻醉，留取血液及組織標本。比較三組間抵抗素、胰島素、血管內皮分泌因子、血脂等血液指標以及主動脈內皮eNOS、ET、PI3K、AKT表達差異。 3、不同干預方法的效果比較。高脂組中(見研究方法2)血清抵抗素大于正常對照組(NC)X+2s的大鼠共52只，從中隨機選取大鼠40只并分為飲食誘導高抵抗素血癥組(HRE組，n=8)及四種干預組，分別為單純調整飲食組(DC組，n=8)、運動+調整飲食組(SW組，n=8)、羅格列酮+調整飲食

6、組(RO組，n=8)、抗體+調整飲食組(AB組，n=8)。正常對照組采用研究方法2中正常對照組(NC組，n=8)。 DC組將高脂飼料改為基礎飼料，不采取其他措施；SW組采用無負重游泳方式，每周游泳5次，每次1小時，水溫29±2℃，喂基礎飼料；RO組給馬來酸羅格列酮(Rosiglitazone)(葛蘭素史克公司生產，文迪雅)2mg/(Kg·d)，灌胃，喂基礎飼料。AB組每日給予抵抗素抗體(Biovendor Laboratory

7、Medicine，Inc.德國)500ug尾靜脈注射，共3天，飲食改為基礎飼料；高抵抗素血癥組不采取干預措施，繼續(xù)高脂飲食至試驗結束。干預持續(xù)8周后，禁食麻醉，留取血液及組織標本待測。比較上述各組抵抗素、胰島素、血管內皮分泌因子、血脂等血液指標以及主動脈內皮eNOS、ET、PI3K、AKT表達差異。 4、血液指標測定： 采用ELISA法測量外周血抵抗素、血漿纖溶酶原激活物抑制劑1(PAI-1)、von Willebran

8、d因子(vWF)；放免法測內皮素(ET)、胰島素(INS)；硝酸還原酶法測一氧化氮(NO)；利用全自動生化分析儀測定血脂：膽固醇(CH)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)，并計算動脈粥樣硬化指數(AI)：AI=(TC-HDL)/HDL。 5、逆轉錄-聚合酶鏈式反應(RT-PCR)方法測定胸主動脈血管內皮eNOS、ETmRNA表達；分別以eNOS、ET擴增條帶吸光度比值(eNOS/actin、ET/

9、actin)作為其表達強度。 6、免疫組化法檢測胸主動脈血管內皮磷脂酰激醇3激酶(PI3K)p85α亞基、絲氨酸/蘇氨酸激酶蛋白激酶B(Akt)-1蛋白表達。 7、原位雜交法檢測胸主動脈血管內皮PI3Kp85α、Akt-1 mRNA表達。 8、采用計算機顯微圖像分析系統(tǒng)計算原位雜交及免疫組化圖像中血管內皮層陽性表達細胞積分光密度(IOD)，作為PI3K與Akt的表達強度。 9、統(tǒng)計學處理：所有數據均以x±s表示，

10、采用SPSS14.0軟件分析；兩組之間比較用t檢驗，多組數據比較用方差分析。試驗指標均經正態(tài)性檢驗，符合正態(tài)分布的指標之間進行person相關分析與partial相關分析(控制混雜因素后進行相關分析)。P＜0.05認為有統(tǒng)計學意義。 研究結論 1、外源性注射大鼠重組抵抗素后，試驗大鼠出現(xiàn)明顯血管內皮分泌功能紊亂，伴有血管內皮細胞活化通路信號PI3K、AktmRNA與蛋白表達的下降。 2、高脂飲食喂養(yǎng)大鼠可以誘導內

11、源性高抵抗素血癥模型及正常抵抗素大鼠。高抵抗素血癥大鼠血清抵抗素水平與脂肪組織抵抗素表達均顯著高于正常抵抗素大鼠。二者都有肥胖、血脂紊亂、動脈粥樣硬化指數升高及不同程度的胰島素抵抗現(xiàn)象。 3、高脂飲食誘導高抵抗素大鼠血管內皮分泌功能紊亂的程度顯著高于高脂飲食正常抵抗素大鼠。高脂飲食誘導高抵抗素大鼠與高脂飲食正常抵抗素大鼠比較，血管內皮細胞PI3K、Akt的mRNA與蛋白表達均顯著降低。 4、肥胖個體中抵抗素升高與血管內皮

12、功能障礙同步發(fā)生，提示血清抵抗素檢測可以作為肥胖個體血管內皮功能障礙的早期預測指標。 5、控制體重、Lee指數、胰島素、血糖、血脂等因素的影響后，血清抵抗素、抵抗素mRNA與內皮分泌因子顯著相關，與PI3K、Akt的表達顯著負相關。提示抵抗素通過PI3K/Akt信號通路引起了血管內皮分泌功能紊亂。 6、調整飲食、運動、羅格列酮、抗體四種方法均可以使血管內皮分泌功能有不同程度改善，伴有血管內皮PI3K、Akt的mRNA與蛋白表達升

13、高。其中運動+調整飲食或羅格列酮+調整飲食的干預效果最好。 創(chuàng)新和意義： 1、在體證實了抵抗素有引發(fā)血管內皮分泌功能障礙的作用。首次比較了高脂飲食狀態(tài)下，不同抵抗素水平個體血管內皮分泌功能的差異；證實了在排除混雜因素后抵抗素是誘導血管內皮分泌功能障礙的獨立危險因素。提出早期檢測并干預抵抗素是預防血管內皮功能障礙的重要環(huán)節(jié)。 2、首次在體研究了抵抗素對內皮細胞活化通路PI3K/AKT蛋白的作用，比較了不同抵抗素水平