膠質(zhì)瘤中Arp2-3蛋白表達(dá)和其在膠質(zhì)瘤細(xì)胞動中作用的研究.pdf

1、膠質(zhì)瘤是顱內(nèi)最常見的腦腫瘤，而膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(glioblastoma multiforme，GBM)是最常見及惡性級別最高的原發(fā)惡性腦腫瘤，占到所有顱內(nèi)腫瘤的12％～15％，星形細(xì)胞腫瘤的60％～75％。盡管手術(shù)切除及術(shù)后輔助同步放化療方案應(yīng)用于膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者取得了一定效果，但膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者的兩年生存率僅約為25％。惡性膠質(zhì)瘤廣泛浸潤到相鄰腦組織以及容易復(fù)發(fā)的趨勢使其難以根治。即使腫瘤在影像學(xué)全切之后，80％以上的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤會在原

2、發(fā)腫瘤邊緣2 cm以內(nèi)復(fù)發(fā)。因此，尋找更好的治療方法，如:有效控制疾病進(jìn)展和復(fù)發(fā)極為必要，其中方法之一就是控制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲和遷移。肌動蛋白相關(guān)蛋白2/3復(fù)合物(actin-related protein2/3 complex，Arp2/3complex)作為小Rho GTP酶-WAVE下游的一個重要效應(yīng)器可以直接調(diào)節(jié)肌動蛋白的聚合作用，在細(xì)胞運動過程中起到不可或缺的作用。當(dāng)細(xì)胞受到外界刺激（如:趨化因子）時，Arp2/3接受Rho

3、GTP酶-WAVE信號轉(zhuǎn)導(dǎo)綁定到原有肌動蛋白絲側(cè)面調(diào)節(jié)新的肌動蛋白絲形成，進(jìn)而形成片狀偽足，為細(xì)胞運動提供必要的動力支持。本文主要研究Arp2/3在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)和對膠質(zhì)瘤細(xì)胞片狀偽足形成的影響以及細(xì)胞運動的調(diào)節(jié)，分為以下兩個部分：
　　 ㈠Arp2/3在人膠質(zhì)瘤中的表達(dá)情況。為探討Arp2/3在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)情況及Arp2/3與膠質(zhì)瘤惡性程度的相關(guān)性，我們收集了50例不同病理級別的膠質(zhì)瘤標(biāo)本以及8例顳葉癲癇手術(shù)患者的對照腦組織

4、。本課題在實驗過程中，首先采用免疫熒光技術(shù)檢測不同標(biāo)本中Arp2/3的表達(dá)情況，結(jié)果顯示在對照腦組織當(dāng)中Arp2/3熒光表達(dá)呈陰性或弱陽性，而在膠質(zhì)瘤組織標(biāo)本中熒光表達(dá)強(qiáng)度明顯增強(qiáng)并且其熒光強(qiáng)度隨著腫瘤級別的增高而增強(qiáng)(F=83.538，P=0.000)。Western blot方法用于進(jìn)一步半定量評估各組織中Arp2/3的表達(dá)情況，結(jié)果顯示對照腦組織當(dāng)中Arp2/3表達(dá)量為15.69±1.04％(n=8)，WHOⅠ級膠質(zhì)瘤標(biāo)本中表達(dá)量

5、為31.17±4.30％(n=8)，WHOⅡ級膠質(zhì)瘤標(biāo)本中Arp2/3表達(dá)量為40.51±2.12％(n=14)，WHOⅢ級膠質(zhì)瘤標(biāo)本中Arp2/3表達(dá)量為48.68±2.69％(n=10)，WHOⅣ級膠質(zhì)瘤標(biāo)本中Arp2/3表達(dá)量為55.42±3.45％(n=18)。數(shù)據(jù)分析顯示膠質(zhì)瘤中Arp2/3表達(dá)量高于對照腦組織當(dāng)中Arp2/3表達(dá)量(P＜0.05)，并且Arp2/3表達(dá)量與膠質(zhì)瘤的病理級別呈正相關(guān)（r=0.686,P=0.02

6、）。
　　 ㈡Arp2/3在膠質(zhì)瘤細(xì)胞片狀偽足形成及細(xì)胞遷移和侵襲中的作用。①我們通過Arp2/3特異性抑制劑下調(diào)Arp2/3活性，探討Arp2/3在膠質(zhì)瘤細(xì)胞片狀偽足形成及細(xì)胞遷移和侵襲中的作用。細(xì)胞免疫熒光技術(shù)和劃痕實驗觀察片狀偽足在細(xì)胞中的形成情況及其與細(xì)胞運動方向的關(guān)系;MTT實驗檢測Arp2/3特異性抑制劑對膠質(zhì)瘤細(xì)胞活性的影響;細(xì)胞免疫熒光技術(shù)觀察Arp2/3在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的定位情況;倒置相差顯微鏡下觀察抑制Arp2

7、/3活性后膠質(zhì)瘤細(xì)胞形態(tài)的變化;體外劃痕實驗和transwell侵襲實驗檢測細(xì)胞的遷移和侵襲能力。結(jié)果:膠質(zhì)瘤細(xì)胞的片狀偽足朝向劃痕區(qū)域;Arp2/3定位到細(xì)胞的片狀偽足，抑制Arp2/3活性后細(xì)胞片狀偽足逐漸變小甚至消失;劃痕實驗和transwell侵襲實驗檢測發(fā)現(xiàn)抑制Arp2/3活性后細(xì)胞運動能力明顯下降(P＜0.05)。②由于抑制藥的特異性畢竟有限，我們通過RNA干擾技術(shù)沉默U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞中Arp2/3的表達(dá)，進(jìn)一步驗證Arp

8、2/3在膠質(zhì)瘤細(xì)胞片狀偽足形成及細(xì)胞遷移和侵襲中的作用。逆轉(zhuǎn)錄PCR和western blot驗證干擾效果;細(xì)胞免疫熒光實驗、劃痕實驗和transwell侵襲實驗檢測敲低Arp2/3后對膠質(zhì)瘤細(xì)胞片狀偽足形成和細(xì)胞運動的影響。結(jié)果:敲低Arp2/3后，U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞中未見明顯片狀偽足形成，并且細(xì)胞的運動能力明顯下降。研究表明：Arp2/3在對照腦組織中無表達(dá)或弱表達(dá)，在不同級別膠質(zhì)瘤中均有表達(dá)，并且表達(dá)水平與膠質(zhì)瘤的病理級別呈正相關(guān)