巨噬細胞移動抑制因子對細胞增殖、遷移、粘附的機理研究.pdf

1、動脈粥樣硬化（AS）是動脈血管壁受損后的慢性炎癥性疾病，盡管采取了積極的血管干預、控制血壓以及調脂等治療手段，目前仍是發(fā)病和死亡的主要原因。本研究通過RNA干擾技術特異性沉默MIF蛋白的表達并觀察MIF對細胞增殖、遷移、粘附中所起的作用并探討其作用機制。 第一部分、siRNA靶向MIF重組逆轉錄病毒載體構建及穩(wěn)定表達細胞株的篩選。 目的：構建并鑒定MIF特異性siRNA重組逆轉錄病毒載體，將其導入phoenix細胞中，篩

2、選出分泌MIF-siRNA病毒的包裝細胞，進而鑒定該病毒上清可抑制MIF蛋白的表達。 方法： 1. pSuper．retroRNAi的設計及合成。 根據(jù)GenBank提供的MIF基因cDNA序列，所選擇MIF的靶點序列分別為： pSRP/MIF-siRNA1 5'-CTATTACGACATGAACGCG-3' pSRP/MIF-siRNA2 5'-CAACTCCACCTTCGCCT

3、AA-3 2. 逆轉錄病毒載體的構建。 將合成的正、反義鏈經(jīng)過變性、復性后形成雙鏈MIF基因siRNA，采用雙鏈定向亞克隆入逆轉錄病毒載體SUPER．retro，轉化大腸桿菌菌株E．coli DH5α，氨芐青霉素（100mg/L）篩選出陽性克隆，提取質粒。 3. 重組質粒MIFsiRNA的鑒定。 重組質粒用EcoRⅠ與HindⅢ酶進行雙酶切，酶切產(chǎn)物行1%瓊脂糖凝膠電泳。陽性克隆分別命名為pSRP/MIF

4、1、pSRP/MIF2，純化后測序鑒定。 4. 重組質粒轉染包裝病毒細胞株。 將包裝病毒細胞phoenix接種到6孔板中，分別使用pSRP、pSRP/MIF1、pSRP/MIF2質粒各4μg，脂質體Lipofectamin200010μl/孔轉染phoenix。轉染后嘌呤霉素篩選3-4周獲得陽性克隆。細胞株命名為phoenix-pSRP、phoenix-pSRP/MIF1 siRNA、phoenix-pSRP/MIF2

5、siRNA。 5. 重組逆轉錄病毒感染HeLa細胞株。 將篩選獲得的phoenix陽性克隆培養(yǎng)至90%融合后換成無嘌呤霉素的完全培養(yǎng)基，24小時后收集細胞上清，濾液-70℃保存。HeLa細胞株接種到6孔板中，加入1ml phoenix細胞上清濾液并加入2μg/ml的聚凝胺，更換含嘌呤霉素的完全培養(yǎng)基篩選培養(yǎng)，約20天篩選完成。所產(chǎn)生的細胞株分別命名為HeLa-pSRP、HeLa-pSRP/MIF1 siRNA、HeLa-

6、pSRP/MIF2 siRNA。 6. Western-blot檢測MIF蛋白的沉默。 將篩選后的HeLa細胞株接種到6孔板中，培養(yǎng)生長至90%時，收集細胞。用細胞裂解液裂解，15%SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，將蛋白質轉移到PVDF膜，用含5%脫脂奶粉的TTBS 37℃封閉1-2h，分別加入兔抗人MIF多克隆抗體（1：1000稀釋），或小鼠抗人GAPDH單克隆抗體（1：1000稀釋）4℃孵育過夜。TTBS漂洗5minx3次

7、；兔抗辣根過氧化物酶標記二抗（1：5000稀釋）37℃孵育1h； TTBS漂洗5 min×3次；SuperSignal Weste Femto敏感曝光試劑盒曝光底片顯影。 第二部分、MIF在細胞生長、遷移、粘附中的作用研究。 目的：探討MIF對細胞生長、遷移、粘附功能的影響和機制。 方法： 1. 細胞培養(yǎng)。 將HeLa-pSRP和HeLa-pSRP/MIF用含1μg/ml嘌呤霉素的完全培養(yǎng)基37℃

8、5%CO2條件下培養(yǎng)，細胞生長至90%左右更換為完全培養(yǎng)基。將細胞消化至12孔板，起始細胞數(shù)為0．1×106/孔，連續(xù)計數(shù)6天。 2. 流式細胞儀檢測HeLa-pSRP、HeLa-pSRP/MIF細胞周期及凋亡。 用Profile Ⅱ型流式細胞儀，在488nm激發(fā)波長下測定細胞DNA，用Multicycle軟件分析細胞周期分布情況。 3. 細胞衰老試驗。 HeLa-pSRP、HeLa-pSRP/MIF消化

9、后將1×105 HeLa-pSRP、HeLa-pSRP/MIF細胞懸液分別進行細胞爬片，待細胞生長至80%左右進行實驗。0．2%戊二醛固定5分鐘后，加入X-gal混合液2ml/孔，放入溫箱孵12小時，鏡檢，陽性細胞為出現(xiàn)藍綠色。 4. 免疫熒光檢測。 將HeLa-pSRP、HeLa-pSRP/MIF細胞分別消化成細胞懸液加已加蓋玻片的6cm培養(yǎng)皿中，待細胞生長至70%后，去除培養(yǎng)液，PBS清洗3次，加入4%多聚甲醛溶液固

10、定20分鐘，后使用0．1%Triton X-100-PBS浸泡10分鐘PBS/0．1%Triton X-100滲透10min，PBS洗滌3次，每次5min； 5%BSA封閉30min后加一抗：p53抗體（1：100稀釋）4℃孵育過夜。PBS清洗3次，每次5分鐘，5%BSA再封閉30 min；加二抗：加入Alexa Fluor 555 rabbit anti-mouse IgG（H+L）（1：1000稀釋）Molecular Probe公

11、司，室溫孵育45分鐘。PBS洗滌5次，每次5min（避光），加入DAPI（1：1000稀釋）室溫染核10分鐘。PBS清洗1次，（避光）封片，在載玻片上滴一滴水溶性封片劑，然后將蓋玻片（培養(yǎng)有細胞的一面朝向水溶性封片劑）從一側輕輕粘在載玻片上，激光共聚焦顯微鏡掃描和照相。 5. 細胞遷移實驗。 在Transwell下室的DMEM培養(yǎng)液中加入10%血清，在Transwell上室分別滴加1×105 HeLa-pSRP、HeLa

12、-pSRP/MIF細胞懸液。將上室置于下室之中，在37℃溫箱孵育。16 h后取出上室，用棉簽將殘留在上室內(nèi)表面上的細胞拭去。上室經(jīng)PBS洗滌后，用4%多聚甲醛固定遷移至上室外表面上的細胞，細胞用含0．1%龍膽紫的20%乙醇染色20分鐘，用清水洗3遍，顯微鏡下（200×）計算遷移細胞數(shù)，結果取5個視野細胞計數(shù)的平均值。 6. 劃痕試驗。 HeLa-pSRP、HeLa-pSRP/MIF細胞鋪6孔板中，當單細胞層生長至95%時

13、，使用10μl槍頭對細胞進行劃痕。分別于0，24小時，36小時，48小時對細胞進行拍照，比較細胞劃痕愈合的速度。 7. 細胞粘附性實驗。 室溫200μl/孔PBS洗滌2遍，胰酶消化HeLa-pSRP、HeLa-pSRP/MIF細胞，制成單細胞懸液，計數(shù)，調整細胞濃度為1×105/ml。每組分別設3個復孔，每孔加入100μl細胞懸液，37℃孵育1h后取出96孔培養(yǎng)板，用PBS洗滌2-3遍，去除未粘附細胞。含0．2%龍膽紫的

14、10%乙醇染色5分鐘，用PBS洗滌3-5遍，每孔加入100μl等體積混勻的0．1MNaH2PO4，PH4．5和50%乙醇以去除殘余染色。酶標儀在波長570nm讀數(shù)。 8. Western-blot檢測。 將篩選后的HeLa細胞株接種到6孔板中，培養(yǎng)至每孔0．1×106時，收集細胞。用適量細胞裂解液裂解，上樣，15%SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，將蛋白質轉移到PVDF膜，用含5%脫脂奶粉的TTBS室溫封閉1-2小時，分別加入兔

15、抗人Cyclin D1、Bcl-2、Bax、FAK、AKT、ERK1/2、和ICAM-1多克隆抗體（1：1000稀釋），鼠抗人p53、p21單克隆抗體1：800稀釋，或小鼠抗人GAPDH單克隆抗體（1：1000稀釋）4℃孵育過夜。TTBS漂洗5min×3次；兔抗辣根過氧化物酶標記二抗（1：5000稀釋）37℃孵育1h； TTBS漂洗5 min×3次；SuperSignal Weste Femto敏感曝光試劑盒曝光底片顯影。 統(tǒng)計

16、方法： 使用SPSS17．0統(tǒng)計軟件，兩組數(shù)據(jù)比較采用兩獨立樣本t檢驗，結果用平均值士標準差（x±S）表示，以P<0．05為有統(tǒng)計學差異。 論文小結： 1．成功構建了針對人MIF基因的siRNA重組逆轉錄病毒載體pSRP/MIF1、pSRP/MIF2。獲得穩(wěn)定抑制MIF表達的細胞株HeLa-pSRP/MIF和表達空載體的對照組細胞HeLa-pSRP。 2．沉默MIF后的HeLa細胞對TNF-α和放線菌酮誘

17、導的凋亡減少，并且沉默MIF后細胞衰老減少。沉默MIF后細胞阻滯在G0/G1期，細胞生長減慢，遷移能力、粘附功能減弱。 3．本研究顯示MIF通過影響cyclinD1、p53、p21表達維持細胞正常生長周期；MIF通過促進p53、p21的表達促進細胞衰老。另外，MIF通過增加Bax表達，促進細胞凋亡。MIF能促進細胞Src、FAK、ICAM-1、AKT、ERK1/2的表達，可能是MIF維持細胞的生長、移動、粘附特性的機制之一。