生物功能化粒子-核酸探針技術(shù)快速檢測病原菌及ATP的研究.pdf

1、病原菌引起的感染性疾病是近年威脅人類健康和造成社會恐慌的主要因素,同時也是造成人類死亡的重要原因。檢測任務(wù)的緊迫性與檢測樣品的復(fù)雜性給傳統(tǒng)病原菌檢測方法提出了嚴(yán)峻的挑戰(zhàn),而傳統(tǒng)的檢測方法由于在特異性、靈敏度、操作簡便性、快捷性等方面存在缺陷,難以滿足日益發(fā)展的病原菌快速檢測的需要。因此發(fā)展病原菌的快速、靈敏和準(zhǔn)確的檢測方法具有十分重要的意義。納米材料有著獨(dú)特的表面效應(yīng)、小尺寸效應(yīng)、量子尺寸效應(yīng)和宏觀隧道效應(yīng),在其表面進(jìn)行各種修飾獲得的各

2、種功能化納米材料與傳統(tǒng)檢測方法相結(jié)合,衍生出具有高通量、高靈敏、快速檢測的方法;核酸探針技術(shù)是目前分子生物學(xué)中應(yīng)用最廣泛的技術(shù)之一,是定性或定量檢測特異RNA或DNA序列的有力工具。本論文以三種納米粒子和核酸探針技術(shù)為基礎(chǔ),結(jié)合新型的檢測工具,發(fā)展了新的靈敏度高、特異性好的病原菌及ATP分子檢測技術(shù)。
　　 本論文主要包括以下幾個研究內(nèi)容:
　　 (1)構(gòu)建了基于免疫磁珠(Immunomolecular magnetic

3、 beads,IMBs)/表面等離子共振技術(shù)(surface plasmon resonance,SPR)的G群鏈球菌(Group G Streptococcus,GGS)快速分離檢測體系。首先通過磁珠(magnetic beads,MBs)表面的不同功能基團(tuán)與抗體分子共價結(jié)合得到三種功能化IMBs。實(shí)驗(yàn)考察了三種MBs與抗體的結(jié)合能力,結(jié)果表明三種磁珠均能很好地結(jié)合抗體分子,醛基化的磁珠結(jié)合能力最佳;實(shí)驗(yàn)還針對免疫磁珠分離鏈球菌的效果

4、進(jìn)行了考察,結(jié)果也表明三種免疫磁珠都能特異地分離樣品中GGS,分離效果亦以醛基化的免疫磁珠效果最好。為了對IMBs分離的GGS進(jìn)行定量分析,本研究聯(lián)合了SPR技術(shù)?；诳贵w分子與GGS的相互作用,在數(shù)十分鐘內(nèi)可以對菌濃度處于1.0×107CFU/ml-1.0×108CFU/ml范圍內(nèi)的GGS進(jìn)行實(shí)時快速檢測。與其它傳統(tǒng)分離方法相比,本研究所采取的分離方法要簡便和快速得多,能在一小時之內(nèi)快速地分離得到目標(biāo)菌。
　　 (2)基于核酸

5、適配體-ATP復(fù)合物與綠色熒光染料Eva GreenTM作用,建立了熒光信號檢測腺嘌呤核苷三磷酸(adenosine-triphosphate,ATP)新方法。體系優(yōu)化了核酸適配體與ATP結(jié)合反應(yīng)的實(shí)驗(yàn)條件。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,核酸適配體與ATP反應(yīng)的最適溫度為12℃;pH值為7.5時,熒光檢測結(jié)果最靈敏;在最優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下,隨著ATP濃度的減小,所測得的熒光信號與空白對照的變化值變小。由檢測結(jié)果可知,當(dāng)ATP濃度從10-6mol/L到10

6、-2mol/L變化,對應(yīng)的熒光強(qiáng)度隨著濃度的減小而增大,呈現(xiàn)一定的線性關(guān)系。因此可作為該范圍濃度的ATP定量檢測的依據(jù)。體系還對該方法的特異性作出了探討,將ATP同類型分子CTP、GTP、UTP作為對照,根據(jù)檢測出的結(jié)果可知該核酸適配體對與ATP分子的檢測具有較強(qiáng)的特異性。相較于其他的檢測方法,本研究所建立的基于核酸適配體-ATP特異識別的熒光檢測技術(shù),對于ATP分子的檢測,不僅反應(yīng)體系特異性高,并且實(shí)驗(yàn)操作簡單,耗時少,成本低?？梢?

7、本研究為之后的分子識別和檢測提供了更為堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。
　　 (3)利用量子點(diǎn)(QD)與金黃色葡萄球菌特異性序列制備了一種功能化QD-DNA探針,基于此探針熒光能量共振轉(zhuǎn)移,建立了一種用于高效檢測金黃色葡萄球菌16s rDNA的方法。本研究詳細(xì)研究了氨基修飾的DNA與羧基修飾的QD不同比值、不同靶序列濃度等條件對熒光強(qiáng)度與熒光能量共振轉(zhuǎn)移效率的影響,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,熒光強(qiáng)度在羧基修飾的QD與氨基修飾的DNA比值為1:80時達(dá)到最大值,

8、熒光能量共振轉(zhuǎn)移效率在靶序列為60nM時趨向于穩(wěn)定并在80nM時效率最高。在最佳實(shí)驗(yàn)條件下,檢測系統(tǒng)最低可檢測至20nM的金黃色葡萄球菌16s rDNA序列,其靈敏度已達(dá)到熒光標(biāo)記的分子信標(biāo)、DNA傳感器、電化學(xué)線性探針等方法檢測下限。實(shí)驗(yàn)結(jié)果亦證實(shí)該方法具有較強(qiáng)特異性?？傊?此方法具有操作簡單、耗時較短、靈敏度及特異性較強(qiáng)等特點(diǎn),為金黃色葡萄球菌的檢測開辟了一條新的道路。
　　 (4)以核酸適配子與配體的特異性識別為基礎(chǔ),以金