EphA-EphrinA信號系統(tǒng)在小鼠視網膜細胞發(fā)育中的表達與意義.pdf

1、目的:
　　研究EphA/EphrinA信號系統(tǒng)在正常小鼠的視網膜發(fā)育過程中的表達，探討EphA/EphrinA在視覺發(fā)育過程中的意義與視網膜感光細胞軸突生長中的導向作用。
　　方法:
　　1.飼養(yǎng)發(fā)育正常新生C57BL/6小鼠60只，在其生長至出生后第1天(P1)、第3天(P3)、第5天(P5)、第7天(P7)、第9天(P9)及4周時隨機選取小鼠10只，麻醉后在解剖顯微鏡下分離同時期的小鼠眼球20只。其中10只眼球解

2、剖后只保留其視網膜，另外10只保持眼球完整性。
　　2.將步驟1中分離的5只完整眼球制成石蠟切片，經HE染色在光鏡下可見不同日齡段的小鼠視網膜發(fā)育情況，特別是P5-P9期間小鼠視網膜外叢狀層的形成過程。
　　3.將步驟1中分離出的10只小鼠視網膜提取mRNA，用RT-PCR的方法檢測EphA/EphrinA信號家族中各個亞類在視網膜的表達情況，篩選出表達量最高的亞類EphA4。
　　4.將步驟1中另外5只完整的小鼠眼球

3、制作成冰凍切片，用步驟3中篩選出的亞類EphA4抗體及特異性表達小鼠感光細胞和雙極細胞的Recoverin抗體，行免疫熒光染色實驗，觀察小鼠視網膜感光細胞軸突生長情況及外叢狀層的形成過程。
　　結果:
　　1.小鼠視網膜發(fā)育中各時期的形態(tài)變化。
　　P1-P3時期小鼠視網膜結構較為單純，內核層及外核層尚未分出，外叢狀層未形成，感光細胞由感光前體細胞分化出，散在分布于神經母細胞層，軸突短細，P5-P7時期視網膜感光細胞成

4、熟，軸突結構趨于完整，向內生長與內核層中新分化出的雙極細胞聯(lián)系，形成外叢狀層，至P9時期，視網膜的各層細胞結構基本穩(wěn)定，外叢狀層結構清晰明確。
　　2.EphA/EphrinA在小鼠的視網膜中的表達。
　　運用GraphPad Prism繪制出統(tǒng)計圖表顯示EphA4在小鼠視網膜中整體表達量最高，EphA6與EphrinA1在視網膜中無表達，EphA4在各個時間點，運用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行單因素反差分析，N=3，得出均

5、數(shù)±標準差:P1(0.48±0.33)，P3(0.55±0.23)，P5（0.76±0.11），P7(1.12±0.88)，P9(0.74±0.08)，4W（0.66±0.07），P＜0.05，差異有統(tǒng)計學意義。
　　3.不同時期小鼠視網膜Recoverin及EphA4表達。
　　P1至P3階段可見Recoverin表達于小鼠視網膜感光細胞胞膜及胞體，散在分布于神經母細胞層，EphA4主要表達于神經節(jié)細胞與內叢狀層，P5-P

6、7可見Recoverin表達的感光細胞軸突發(fā)育成熟，外叢狀層形成，個別感光細胞散在于內核層中表達，軸突延伸至內核層，EphA4表達于節(jié)細胞層至內核層，較P1-P3期表達強烈。P9中Recoverin強表達于外核層中感光細胞的胞膜、胞體及軸突上，可見感光細胞成熟形態(tài)，軸突集中至外叢狀層，外叢狀層穩(wěn)定形成，雙極細胞在內核層初步形成，亦有Recoverin的較弱表達，EphA4在內叢狀層及外叢狀層的表達最為強烈，形成兩條平行的熒光帶，而外核層