鈣敏感受體通過(guò)胱硫醚-γ-裂解酶調(diào)控內(nèi)源性H2S抑制巨噬細(xì)胞泡沫化的機(jī)制研究.pdf

1、動(dòng)脈粥樣硬化(AS)是心腦血管疾病的主要病理基礎(chǔ)，其主要表現(xiàn)為大動(dòng)脈及中動(dòng)脈的血管內(nèi)壁出現(xiàn)脂質(zhì)沉積，形成分散的或成片的粥樣斑塊，造成動(dòng)脈管腔狹窄，隨后斑塊破裂出血，可以在狹窄的動(dòng)脈內(nèi)形成血栓，導(dǎo)致缺血性腦卒中、心肌梗死的發(fā)生。引起AS的原因很復(fù)雜，除高血壓外，脂質(zhì)代謝紊亂，炎癥反應(yīng)以及自身免疫也是重要因素。所以，預(yù)防AS的發(fā)生并防止其發(fā)展，對(duì)防治心腦血管疾病有重要意義。
　　硫化氫(H2S)是新發(fā)現(xiàn)的一種內(nèi)源性氣體信號(hào)分子。內(nèi)源性

2、H2S是機(jī)體多種細(xì)胞內(nèi)半胱氨酸在胱硫醚-β-合成酶(CBS)、胱硫醚-γ-裂解酶(CSE)和半胱氨酸轉(zhuǎn)移酶催化作用下產(chǎn)生的。其中CSE能大量地表達(dá)于血管平滑肌細(xì)胞(VSMC-s)、動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞(ECs)和單核源性巨噬細(xì)胞并產(chǎn)生H2S，是心血管系統(tǒng)H2S的主要來(lái)源，而CSE催化產(chǎn)生的內(nèi)源性H2S不但在擴(kuò)張血管、促進(jìn)凋亡和抑制增殖等方面起作用，還在AS的形成過(guò)程中起到重要作用。
　　鈣敏感受體(CaR)是G蛋白偶聯(lián)受體家族中C家族的成

3、員。已有研究報(bào)道CaR在巨噬細(xì)胞中不僅存在表達(dá)，而且能夠通過(guò)G蛋白-PLC-IP3通路引起細(xì)胞內(nèi)Ca2+含量的增加，細(xì)胞內(nèi)Ca2+含量的增加又可以通過(guò)Ca2+/CaM通路增強(qiáng)鈣調(diào)蛋白(CaM)的活性，從而抑制巨噬細(xì)胞向泡沫細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。還有研究報(bào)道高表達(dá)的CaM可以通過(guò)提高CSE的活性，促進(jìn)H2S的生成來(lái)抑制泡沫細(xì)胞的形成。但CaR是否能夠通過(guò)促進(jìn)巨噬細(xì)胞內(nèi)CSE的表達(dá)和H2S的分泌來(lái)抑制泡沫細(xì)胞的形成尚不得而知。 PI3K/Akt信號(hào)通

4、路是維持細(xì)胞生存、增殖最重要的信號(hào)傳導(dǎo)通路之一，可以直接影響AS的發(fā)生發(fā)展。研究證實(shí)CaR可以通過(guò)影響PI3K/AKT信號(hào)通路的傳導(dǎo)來(lái)抑制巨噬細(xì)胞向泡沫細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，但CaR調(diào)控PI3-K/AKT信號(hào)通路傳導(dǎo)的具體機(jī)制尚不清楚。因此，本文以巨噬細(xì)胞作為研究對(duì)象，利用ox-LDL誘導(dǎo)泡沫細(xì)胞形成，探討高表達(dá)的CaR是否能夠通過(guò)增強(qiáng)CSE的表達(dá)及促進(jìn)H2S的分泌來(lái)抑制巨噬細(xì)胞向泡沫細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，同時(shí)研究CaR調(diào)控CSE的表達(dá)是否與CaM有關(guān)。<

5、br>　　材料與方法：
　　一、實(shí)驗(yàn)材料
　　細(xì)胞株
　　THP-1人單核巨噬細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所，該細(xì)胞株屬人類單核細(xì)胞系。
　　二、主要研究方法
　　1、細(xì)胞培養(yǎng)及建立泡沫細(xì)胞模型
　　2、敏感硫電極法檢測(cè)巨噬細(xì)胞中H2S含量的變化。
　　3、激光掃描共聚焦顯微鏡(LSCM)測(cè)定巨噬細(xì)胞內(nèi)游離鈣的變化。
　　4、HPLC測(cè)定細(xì)胞內(nèi)膽固醇含量及油

6、紅O染色檢測(cè)陽(yáng)性細(xì)胞的相對(duì)含量。
　　5、ELISA法檢測(cè)細(xì)胞因子IL-10、MIF和TNF-a的分泌情況。
　　6、RT-PCR、Q-PCR法檢測(cè)各組細(xì)胞中CaR和CSE的表達(dá)。
　　7、Western blot法檢測(cè)各組細(xì)胞中CaR、CSE、PI3K、p-AKT、CD36和AC-AT-1的表達(dá)。
　　8、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:所有數(shù)據(jù)均用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，所得結(jié)果用均數(shù)±SD表示，采用ANOVA分析。P

7、＜0.05認(rèn)為有顯著性差異并在統(tǒng)計(jì)學(xué)上有意義。
　　結(jié)果：
　　1、敏感硫電極法檢測(cè)H2S的相對(duì)含量結(jié)果顯示:與空白對(duì)照組比較，CaR激動(dòng)劑GdCl3(10ug/ml)組和NaHS(70ug/ml)組作用泡沫細(xì)24、48和72h后，H2S的相對(duì)含量明顯增加（P＜0.05），但當(dāng)其作用超過(guò)48h以后這種促進(jìn)H2S分泌的作用不再明顯增強(qiáng);而CaR抑制劑NPS2390(50ug/ml)組作用泡沫細(xì)胞24、48和72h后，細(xì)胞H2S

8、的相對(duì)含量明顯降低（P＜0.05），但當(dāng)其作用超過(guò)48h以后這種抑制H2S分泌的作用不再明顯增強(qiáng)。與空白對(duì)照組比較，GdCl3組作用泡沫細(xì)胞48后H2S的相對(duì)含量明顯增加（P＜0.05）;而GdCl3+CSEsiRNA組和CSEsiRNA組H2S的相對(duì)含量明顯降低（P＜0.05）。
　　2、油紅O染色檢測(cè)和HPLC檢測(cè)結(jié)果顯示:與空白對(duì)照組比較，GdCl3和NaHS組作用泡沫細(xì)胞24、48和72h后，巨噬細(xì)胞泡沫化程度均明顯降低（

9、P＜0.05），但當(dāng)其作用超過(guò)48h以后這種抑制巨噬細(xì)胞向泡沫細(xì)胞轉(zhuǎn)化的作用不再明顯增強(qiáng);而NPS2390組作用泡沫細(xì)胞24、48和72h后，巨噬細(xì)胞泡沫化程度明顯增加（P＜0.05），但當(dāng)其作用超過(guò)48h以后這種促進(jìn)巨噬細(xì)胞向泡沫細(xì)胞轉(zhuǎn)化的作用不再明顯增強(qiáng)。
　　3、ELISA法檢測(cè)作用24、48和72h后的各組細(xì)胞上清中IL-10、TNF-a和MIF的分泌情況:結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組比較，GdCl3和NaHS組細(xì)胞上清中TNF

10、-a和MIF含量均明顯降低，而IL-10的含量明顯增多(P＜0.05);NPS2390組細(xì)胞培養(yǎng)的上清中TNF-a和MIF的含量均明顯增加，而IL-10的含量明顯降低（P＜0.05）。
　　4、RT-PCR、Q-PCR、Western blot法檢測(cè)CaR和CSE的表達(dá)情況:結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組比較，GdCl3組CaR和CSE的表達(dá)均明顯增加，而CD36和A-CAT-1的表達(dá)被明顯抑制(P＜0.05);NPS2390組CaR和C

11、SE的表達(dá)均明顯被抑制，而CD36和ACAT-1的表達(dá)被明顯增強(qiáng)（P＜0.05）;NaHS組CaR和CSE的表達(dá)無(wú)明顯變化，而CD36和ACAT-1的表達(dá)被明顯抑制（P＜0.05）。
　　5、RT-PCR、Q-PCR和Western blot檢測(cè)CSE、PI3K和p-AKT的表達(dá)情況:結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組比較，GdCl3組明顯增強(qiáng)CSE的表達(dá)，而PI3K和p-AKT的表達(dá)被明顯抑制;CaM抑制劑(U73122)組和GdCl3+C

12、aM抑制劑(U73122)組PI3K和p-AKT的表達(dá)被明顯增強(qiáng)，而CSE的表達(dá)被明顯降低(P＜0.05)。
　　6、LSCM檢測(cè)作用48h后的各組細(xì)胞Ca2+熒光強(qiáng)度變化，結(jié)果顯示:與空白對(duì)照組比較，GdCl3組、U73122組和GdCl3+U73122組細(xì)胞質(zhì)內(nèi)Ca2+熒光強(qiáng)度均明顯增加（P＜0.05）。
　　7、敏感硫電極法檢測(cè)H2S的相對(duì)含量結(jié)果顯示:與空白對(duì)照組比較，GdCl3組作用泡沫細(xì)胞48后H2S的相對(duì)含量明

13、顯增加（P＜0.05）;而U73122組和GdCl3+U73122組H2S的相對(duì)含量明顯降低（P＜0.05）。
　　8、油紅O染色檢測(cè)和HPLC檢測(cè)結(jié)果顯示:與空白對(duì)照組比較，GdCl3組作用泡沫細(xì)胞48h后，巨噬細(xì)胞泡沫化程度明顯降低（P＜0.05），而U73122組和GdCl3+U73122組巨噬細(xì)胞泡沫化程度均明顯增加(P＜0.05)。
　　結(jié)論：
　　1、證實(shí)CaR可以增強(qiáng)CSE的表達(dá)，促進(jìn)內(nèi)源性H2S的分泌，