微小RNA miR-1和miR-206促進成肌分化的作用及其機制研究.pdf

1、利用成體干細胞進行細胞替代治療或聯(lián)合基因治療是近幾年提出的修復組織損傷的新思路。基于成體干細胞的治療策略能否安全、有效的達到目的在很大程度上取決于我們對成體干細胞增殖與分化的分子機制的認識。細胞分化的核心問題是基因表達在時間和空間上的精確調(diào)控，一種新的細胞表型的建立需要相關(guān)調(diào)控基因的打開和關(guān)閉以適應新的功能。近年來發(fā)現(xiàn)，一類叫做microRNAs的非編碼小RNA分子，在調(diào)控特定細胞增殖、分化進程等方面起著重要作用，特別是其在維持干細胞定

2、向分化和自我更新功能中的作用逐漸被揭示，成為目前干細胞研究中的一個新的亮點和熱點。某些miRNAs具有組織表達分布的特異性，提示它們與該組織的分化和特定功能的維持有關(guān)。早期的miRNAs克隆結(jié)果和基于高通量芯片的組織表達譜分析顯示，miR-1，miR-133和miR-206在小鼠的肌肉組織呈特異性表達，而它們在肌肉發(fā)育、增殖和分化中的作用尚知之不多。明確這些miRNAs在成體干細胞增殖分化中的作用，將為我們利用成體干細胞進行相關(guān)肌損傷修

3、復治療提供新的線索。 本課題擬利用肌母細胞C2C12體外成肌分化模型，檢測肌肉組織特異性表達的miRNAs在成肌分化中的表達變化，通過gain-of-function觀察部分肌肉組織特異性表達的miRNAs對成肌分化的影響，并利用生物信息學和相關(guān)實驗手段預測、分析和驗證它們可能的靶基因，同時檢測這些miRNAs在某些肌肉損傷過程中的表達變化，并構(gòu)建相應的治療性載體，初步探討其在促進成肌分化中的意義，為進一步探明miRNAs調(diào)控骨

4、骼肌增殖與分化的分子機制、探索成體干細胞定向分化的新策略提供理論指導和實驗依據(jù)。 本研究內(nèi)容主要包括三部分： 一、肌肉組織特異性miRNAs在C2C12細胞體外成肌分化過程中的表達改變 建立C2C12細胞體外成肌分化和以TNF-α為干預因素的抑制分化模型，通過形態(tài)學改變，肌球蛋白重鏈免疫熒光組織化學和肌分化相關(guān)基因的RT-PCR對上述模型進行評價，采用Northern blot檢測肌肉組織特異性的miR-1、mi

5、R-133和miR-206在上述模型的表達變化情況。 二、miR-1和miR-206促進成肌分化的作用和機制研究 根據(jù)上述研究結(jié)果并結(jié)合最新進展，確定進一步深入研究miR-1和miR-206在成肌分化過程中的功能?；瘜W合成miR-1和miR-206，將其以200nM的濃度分別轉(zhuǎn)染至C2C12細胞，形成gain-of-function狀態(tài)后進行誘導分化，采用形態(tài)學、肌球蛋白重鏈免疫熒光組織化學和肌肉功能蛋白skeletal

6、-α-actin的Western blot對其分化效應評價。 采用生物信息學方法，利用軟件PiTar、miRanda和TargetScan4.2分析miR-1和miR-206可能作用的候選靶基因。根據(jù)上述研究結(jié)果并結(jié)合最新進展，分析候選靶基因在成肌分化過程中及過表達miR-1和miR-206后的變化特點，進一步篩選與miR-1和miR-206表達相關(guān)聯(lián)的基因。 利用熒光素酶報告系統(tǒng)驗證候選靶基因。為了明確熒光素酶報告系統(tǒng)

7、的敏感性和特異性，構(gòu)建陽性對照質(zhì)粒pmiR-206-Luc reporter。將位于候選靶基因3‘UTR含有預測miR-1和206作用位點約500bp區(qū)域克隆至pMIR-Lac內(nèi)熒光素酶3'UTR，并進行酶切和測序驗證。 三、檢測肌肉組織特異性miRNAS在骨骼肌失神經(jīng)萎縮中的表達變化并構(gòu)建miR-1的腺病毒表達載體進行促成肌分化的初步研究。 建立小鼠腓腸肌去神經(jīng)支配萎縮模型，Northern blot檢測miR-1、m

8、iR-133和miR-206在該模型的表達變化。著眼于以后的治療應用，利用PCR從小鼠基因組擴增含有miR-1-1的DNA片段，連接至pAdTrack-CMV中后轉(zhuǎn)化含pAdEasy-1的感受態(tài)BJ5183，通過同源重組獲得腺病毒載體質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染293包裝病毒顆粒，Northern blot驗證成熟miR-1表達情況。利用miR-1重組腺病毒感染C2C12細胞，誘導分化72h通過形態(tài)學、肌球蛋白重鏈免疫熒光組織化學和肌肉功能蛋白skele

9、tal-α-actin的Western blot等指標評價其對分化的影響。 通過以上三部分的實驗研究與分析，獲得以下主要結(jié)果： 1、成功建立C2C12細胞體外成肌分化和以TNF-α為干預因素的抑制分化模型。C2C12細胞以2％馬血清進行成肌分化誘導，3-5d可見多核肌管，MHC免疫熒光呈胞漿陽性，RT-PCR檢測myoD、myoG和skeletal-α-actin分化相關(guān)基因誘導分化后表達明顯上調(diào)，證實我們所建立的C2C

10、12細胞成肌分化模型是成功的。另一方面，觀察到TNF-α是C2C12細胞成肌分化的負向調(diào)控因子。TNF-α作用后上述成肌分化相關(guān)的標志分子均不同程度受到抑制，建立了應用TNF-α抑制成肌分化的模型，用于后續(xù)研究。 2、明確了肌肉組織特異性miRNAs miR-1，miR-133和miR-206在上述模型的表達變化。在正常成肌分化模型中三者隨著誘導時間的延長，在分化過程中表達量升高明顯；在誘導分化培養(yǎng)基中加入20ng/mlTNF-

11、α后成肌分化受抑，三者表達也受到明顯抑制。 3、揭示miR-1和206能夠促進成肌分化。在C2C12細胞轉(zhuǎn)染化學合成miR-1和206后24h進行誘導分化，誘導48h后進行效應評價。結(jié)果顯示，在TNF-α(-)組，轉(zhuǎn)染miR-1和206后與陰性對照比較，MHC陽性細胞數(shù)目明顯較多，skeletal-α-actin水平分別為對照的1.37倍和1.23倍。在TNF-α(+)組，各組MHC陽性細胞數(shù)目明顯少于TNF-α(-)組，轉(zhuǎn)染m

12、iR-1和206后與陰性對照比較，MHC陽性細胞數(shù)目明較多，skeletal-α-actin表達水平分別為對照的2.08倍和1.69倍，加入TNF-α這一干預因素后，凸顯了miR-1和206的促分化效應。 4、發(fā)現(xiàn)CCND1和FOXP1是miR-1和miR-206作用的靶基因。利用在線生物信息學軟件PiTar、miRanda和TargetScan4.2預測miR-1和miR-206可能作用的靶基因，并結(jié)合其在成肌分化過程中的表達

13、變化特點確定CCND1和FOXP1兩個基因做進一步深入研究。進一步通過gain-of-function研究證實CCND1和FOXP1符合靶基因的表達變化特點。進而，將CCND1和FOXP1的3'UTR含有預測作用位點約500bp的片段常規(guī)方法連接到pMIR-Luc的熒光素酶3'UTR，成功構(gòu)建pmiR-Luc-CCND1-3'UTR、pmiR-Luc-FOXP1-YUTR-1和pmiR-Luc-FOXP1-3'UTR-2等3個重組質(zhì)粒。

14、分別與pMIR-β-gal及合成之miRNAs共轉(zhuǎn)染293細胞，計算分析Luc/β-gal值，結(jié)果顯示，對pmiR- Luc-CCND1-3’UTR miR-1和miR-206可使其熒光素酶活性分別下降47.7％和39.3％；對pmiR-Luc-FOXP1-3'UTR-2 miR-1和miR-206可使其熒光素酶活性分別下降46.9％和40.7％；miR-1和miR-206未對pmiR-Luc-FOXP1-3'UTR-1的熒光素酶活性造

15、成影響。 5、明確在小鼠腓腸肌去神經(jīng)支配所致骨骼肌萎縮過程中肌肉組織特異性miRNAs的表達變化情況。與對照組相比，miR-206隨著失神經(jīng)支配時間的延長其在肌肉組織中的表達明顯上調(diào)，第28d其強度可達到對照的5倍以上；miR-1和miR-133隨著失神經(jīng)支配時間的延長其表達先迅速下調(diào)，而后逐漸回升，但至失神經(jīng)支配后第28d仍明顯低于正常水平。 6、成功構(gòu)建miR-1的腺病毒表達載體，并初步觀察利用其促進C2C12分化的

16、作用，為以后利用其進行實驗治療打下基礎(chǔ)。利用PCR在小鼠基因組中擴增含有miR-1-1的DNA片段，正確連接至穿梭質(zhì)粒pAdTrack-CMV中，然后轉(zhuǎn)化含有骨架質(zhì)粒pAdEasy的感受態(tài)大腸桿菌BJ5183，通過同源重組產(chǎn)生腺病毒載體質(zhì)粒pAdEasy/miR-1-1，轉(zhuǎn)染293細胞后包裝出重組腺病毒pAd-miR-1-1，感染293后行Northern blot驗證成熟miR-1分子能夠高效表達。制備高滴度病毒顆粒感染C2C12，誘

17、導成肌分化72 h進行評價，結(jié)果表明，感染Ad-miR-1后MHC陽性細胞數(shù)目增多，skeletal-α-actin水平為對照的1.21倍；加入TNF-α后，Ad-miR-1組細胞MHC陽性細胞數(shù)目明顯增多，α-actin接近對照不加入TNF-α的水平，表明Ad-miR-1可以明顯促進成肌分化。 研究結(jié)論如下： 1、成功建立C2C12細胞體外成肌分化和TNF-α干預分化的模型，明確了肌肉組織特異性miRNAs在上述模型的