中華眼鏡蛇毒金屬蛋白酶MT和烙鐵頭蛇毒TM-N49誘導人肥大細胞釋放組胺的研究.pdf

1、背景與目的:
　　肥大細胞激活后脫顆粒釋放類胰蛋白酶、類糜蛋白酶、肝素、組胺及其它化學介質成分,參與許多慢性炎癥反應如應激誘發(fā)的腸道潰瘍、類風濕關節(jié)炎、間質性膀胱炎、硬皮病及克隆氏病等,尤其是在變態(tài)反應性疾病中起著至關重要的作用。變態(tài)反應性炎癥包括支氣管哮喘、變應性鼻炎、變應性皮炎、食物及藥物過敏等,發(fā)病率約占全球人口的30％-40%,并有逐年增長的趨勢。由于變態(tài)反應性炎癥對人類的危害極大,所以于2000年末被世界衛(wèi)生組織定為三大

2、非傳染性疾病項目之一。近年,越來越多的證據(jù)證明肥大細胞激活后釋放的主要介質可能是引起變態(tài)反應性炎癥發(fā)病的關鍵機制。肥大細胞的這種脫顆粒反應,既是機體的一種防御反應,也是速發(fā)型變態(tài)反應和炎癥等病理反應的基礎,圍繞穩(wěn)定肥大細胞而產生的療法將會成為今后一段時間內治療變態(tài)反應性疾病的主流。探討肥大細胞激活途徑及其機制能給治療變態(tài)反應性炎癥及其它與肥大細胞相關的疾病的治療提供新思路。
　　目前對于肥大細胞的IgE依賴性激活途徑的研究已進行得

3、很深入,其機制已開始明朗;但非IgE依賴性激活途徑的確切作用機制還不甚明了。本研究所在“長江學者”何教授帶領下經(jīng)過多年努力,提出了肥大細胞自身放大機制的假說,并逐漸完善,這是對肥大細胞激活機制的新發(fā)現(xiàn)。
　　人被毒蛇咬傷后局部可見明顯組織壞死和炎癥,早期蛇毒與肥大細胞之間的作用在動物上研究過,發(fā)現(xiàn)眼鏡蛇毒等能誘導大鼠橫隔膜、腹膜和幾尼豬肺部肥大細胞釋放組胺,其激活肥大細胞的方式是非IgE依賴性的,但蛇毒對人肥大細胞的作用尚未見文獻

4、報道。我們用純化的蛇毒MT、TM-N49與人肺、大腸及扁桃體組織肥大細胞共同孵育,觀察其對人肥大細胞釋放組胺的誘導作用,探討人肥大細胞非 IgE依賴性激活的作用機制,給變態(tài)反應性炎癥及其它相關疾病的治療提供參考資料。
　　方法:
　　將粗中華眼鏡蛇毒粉溶于緩沖液中,上肝素凝膠柱和Superdex75親和力凝膠柱純化MT;將粗烙鐵頭蛇毒粉溶于緩沖液中,上SP-Sephadex C-25柱,肝素凝膠柱, Superdex75分子

5、篩及HPLC純化TM-N49。將手術切除的人肺、大腸和扁桃體組織在無菌條件下細細剪碎,在37℃條件下用Ⅰ型膠原酶和Ⅰ型透明質酸酶消化,用100μm的濾網(wǎng)過濾,經(jīng)懸浮后的細胞均勻地加入含MT、TM-N49、刺激劑或緩沖液的試管中,在37℃條件下進行激發(fā)實驗,激發(fā)管在4℃離心機中2000 rpm離心10 min后,收集細胞激發(fā)上清,用熒光顯色法測量上清液的組胺水平。
　　結果:
　　純化后的MT在SDS-PAGE上呈1條帶。MT

6、能誘導人肺、大腸和扁桃體肥大細胞發(fā)生劑量依賴性組胺釋放,其誘導方式為非 IgE依賴性。濃度低至0.03μg/ml時, MT就能誘導大腸肥大細胞顯著性的組胺釋放,但對于肺和扁桃體的肥大細胞, MT的最低有效濃度分別為0.3μg/ml和30μg/ml。 MT誘導大腸和肺肥大細胞組胺釋放,12 min時達高峰,而扁桃體肥大細胞的組胺釋放則在8 min時達高峰。人大腸、肺和扁桃體肥大細胞經(jīng)代謝抑制劑和百日咳毒素預處理后,MT誘導其釋放組胺的作用

7、明顯減弱。缺乏外源性鈣、鎂離子時,MT誘導肥大細胞釋放組胺的能力也明顯減弱。
　　純化后的TM-N49在SDS-PAGE上呈一條帶。TM-N49能誘導人肺、大腸和扁桃體肥大細胞發(fā)生劑量依賴性組胺釋放。濃度為0.3μg/ml時, TM-N49就能誘導大腸肥大細胞顯著性的組胺釋放,但對于人肺肥大細胞來說,誘導它釋放相同量組胺所需最低TM-N49濃度為3μg/ml,而對于扁桃體肥大細胞,TM-N49濃度為30μg/ml時才能誘導它顯著性

8、的組胺釋。TM-N49誘導大腸和肺肥大細胞組胺的釋放10 min和8 min時達高峰,而扁桃體肥大細胞的組胺釋放則在16 min時達高峰。人大腸、肺和扁桃體肥大細胞經(jīng)代謝抑制劑和百日咳毒素預先處理后,濃度低于30μg/ml的TM-N49誘導其釋放組胺的作用明顯減弱,但當其濃度達到30μg/ml時,上述處理對TM-N49誘導人肥大細胞釋放組胺的作用無影響。缺乏外源性鈣、鎂離子時,TM-N49誘導肥大細胞釋放組胺的能力也明顯減弱。