HP-PRRSV疫苗株HuN4-F112感染PAM效率降低的分子機理的研究.pdf

1、豬繁殖與呼吸綜合征(PRRS)是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)引起的、嚴重危害生豬養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的重要疫病之一。臨床表現(xiàn)為妊娠母豬流產(chǎn)、死胎和產(chǎn)木乃伊胎，仔豬發(fā)病多表現(xiàn)為呼吸障礙。該病于1987年首次在美國爆發(fā)，隨后在北美洲及歐洲各國流行，引起母豬爆發(fā)流產(chǎn)風暴。國內于1996年首次分離到PRRSV毒株命名為CH-1a株，2006年下半年開始，一種以高熱（超過41℃）、高發(fā)病率（超過50％）和高死亡率（高于20％）為主要特征的“無名高熱

2、癥”在我國江西省爆發(fā)，并迅速蔓延至全國28個省、市和自治區(qū)，造成了巨大的經(jīng)濟損失。經(jīng)鑒定該病的病原為PRRSV變異株-高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒(HP-PRRSV)。鑒于該病的嚴重危害，中華人民共和國農(nóng)業(yè)部于2008年將高致病性豬繁殖與呼吸綜合征(HP-PRRS)列為我國的一類動物疫病。
　　經(jīng)實踐證明將PRRSV野毒在Marc-145細胞系上連續(xù)傳代的方式是制備PRRSV疫苗的有效手段。2010年以來陸續(xù)有3種HP-PRRS

3、V活疫苗通過上述方法研制成功，隨著HP-PRRSV弱毒活疫苗在我國的使用，HP-PRRS得到了有效地防控，了解疫苗的分子致弱機理對于PRRS的防控具有指導意義。PRRSV對巨噬細胞具有細胞嗜性，豬肺泡巨噬細胞(PAM)被認為是PRRSV在宿主內復制的主要靶細胞，由于PAM是重要的免疫細胞，具有抗原遞呈作用，因此PRRSV野毒感染宿主的PAM被認為是PRRS造成免疫抑制的重要原因。在研究中我們發(fā)現(xiàn)將疫苗株HuN4-F112接種PAM后48

4、h，取上清接種下一代PAM，連續(xù)感染3次，利用RT-RCR方法從最后一代PAM中檢測不到病毒的核酸，這表明HP-PRRSV活疫苗HuN4-F112株在體外對PAM的感染與親本毒HP-PRRSV HuN4存在顯著差異，采用同樣的方法對其他3株PRRSV弱毒活疫苗(MLV、CH-1R)檢測均得到了對PAM的感染能力顯著下降的結果。由于上述疫苗株均是在Marc-145細胞中傳代80次以上致弱的，因此我們推斷在傳代過程中關鍵基因的突變可能是導致

5、疫苗株對PAM感染能力的降低的重要原因，確定該關鍵基因對PRRSV致病機理的研究和PRRS的防控具有重大意義。
　　為鑒定影響PRRSVY疫苗株HuN4-F112影響PAM感染效率的關鍵基因，本研究以2株感染性克隆cHuN4（以親本株HP-PPRSV HuN4基因組序列構建）和cHuN4-F112(以疫苗株HP-PRRSV HuN4-F112)為骨架，利用分子克隆技術置換相應的基因，構建了10個嵌合的感染性克隆質粒，最終拯救出10

6、株嵌合病毒。采用熒光定量PCR確定病毒原液中病毒密度，分別以Moi=2.0感染4×106 PAM細胞，感染24h分別以抗PPRSV的M蛋白的單克隆抗體和FITC標記的羊抗鼠IgG抗體染色，最后利用流式細胞術評價病毒對PAM的感染效率。通過逐步的截短替換證明，分別以疫苗株和親本株感染性克隆為骨架分別互換NSP2基因拯救的兩株嵌合病毒感染PAM的效率發(fā)生顯著的改變，其中親本株HuN4的感染效率顯著下降，而疫苗株的感染效率顯著上升，這表明NS

7、P2基因是影響了HP-PRRSV疫苗株HuN4-F112在PAM感染效率的關鍵基因。
　　為鑒定影響NSP2功能的關鍵氨基酸，以感染性克隆cHuN-F112和RQNSP2(cHuN-F112為骨架替換cHuN的NSP2基因的嵌合質粒)為骨架利用定點突變技術，分別將NSP2基因上存在差異的氨基酸位點定點突變，構建了10株NSP2突變體。通過PAM感染試驗及流式細胞術檢測發(fā)現(xiàn)，以RQNSP2為骨架將第893位氨基酸由V893突變?yōu)锳8

8、93的病毒和將第979位氨基酸由由S979突變?yōu)镻979的兩株突變體PAM感染效率下降顯著，而以cHuN-F112為骨架同時將ORF1a上第893位和979位氨基酸同時突變后，嵌合病毒感染PAM效率顯著提高，這表明ORF1a上第893和979位氨基酸為影響NSP2功能的關鍵氨基酸。
　　為了探索NSP2基因突變影響疫苗株HuN4-F112對PAM感染效率的作用機理，分別將4株互換NSP2或ORF2-7基因的重組病毒及親本毒HuN4

9、和疫苗株HuN4-F112以Moi=5.0感染PAM細胞。于感染2h、12h、24h、36h和48h分別收集細胞，細胞用PBS反復沖洗離心后去上清提取總RNA，將600 ng RNA反轉錄成cDNA，最后使用熒光定量PCR檢測分析。檢測結果顯示感染2h檢測6株病毒均可侵入PAM細胞且6株病毒拷貝密度不存在明顯的差異，在感染后12～24 h6株病毒基因組RNA均呈現(xiàn)快速復制并且其復制規(guī)律相同，這表明疫苗株NSP2的突變并未影響病毒侵入宿主

10、也未影響病毒基因組RNA的合成。感染36～48 h疫苗株HuN4-F112和嵌合HuN4-F112的NSP2基因的HuN4病毒的RNA合成增長緩慢并呈下降趨勢，而親本株HuN4和以cHuN4-F112為骨架替換親本株NSP2基因的嵌合病毒RNA合成量繼續(xù)增加;本實驗室以前的試驗數(shù)據(jù)表明，PAM分別被HuN4和HuN4-F112感染后，組裝病毒粒子的蛋白表達量存在明顯差異:通過Western blot檢測顯示當被HuN4感染24h時，PA

11、M細胞中病毒GP3蛋白的表達量即接近峰值，且24～48h內可持續(xù)檢測到GP3蛋白的大量表達;但PAM被感染HuN4-F112感染后直至36 h才能檢測到微量的GP3蛋白的表達，且直至感染后48 h病毒GP3蛋白的表達量仍是微量的;當兩株病毒互換NSP2蛋白后，結果發(fā)生了逆轉。結合熒光定量PCR和流式細胞術檢測的結果推測，在PAM中疫苗株HuN4-F112 NSP2基因的突變導致病毒RNA轉錄病毒結構蛋白的功能顯著降低或推遲，進而影響病毒

12、粒子的組裝和釋放，最終表現(xiàn)為疫苗感染PAM效率的顯著下降。
　　在體外PAM中接種HP-PRRSV疫苗株HuN4-F112幾乎檢測不到病毒粒子，但疫苗株免疫仔豬后可監(jiān)測到3-4周的病毒血癥，這表明在宿主體內除PAM外疫苗株還存在其他病毒儲存或復制的組織。本研究分別以106.0TCID50的疫苗株HuN4-F112感染5頭仔豬，并以3×104.0TCID50的HP-PRRSV HuN4株感染3頭仔豬作為攻毒對照組，以1頭仔豬做為空白

13、對照，感染后10d、11d、14d和16d分別將其迫殺，采集心、肝、脾、腎等臟器及頜下淋巴結、肺門淋巴結、腹股溝淋巴結和PBMC等淋巴器官和扁桃體、胸腺等免疫器官。將上述組織研磨后取活細胞，采用流式細胞術評價各組織細胞被感染比例。結果顯示疫苗免疫組仔豬在感染后10～16d體內仍存在病毒血癥，但其外周血淋巴細胞(PBMC)被感染率幾乎為零，其PAM感染率較低，主要儲存器官為扁桃體，感染率最高可達11.5％，其感染比例有隨感染時間推移增高的

14、趨勢;此外在各個淋巴結細胞中也檢測到了病毒感染;各臟器組織中心臟和脾臟細胞被感染的比例最高，肝細胞和腎細胞感染比例不顯著;重要的免疫器官胸腺中未被感染。攻毒對照組中，PAM被感染率比疫苗組高，但最高的感染比例也僅為5.3％，這可能與大部分感染的PAM細胞已經(jīng)破碎有關。感染率最高的組織為扁桃體，其細胞被感染率分別為14.1％、16.6％和30.7％，此外其淋巴結細胞和脾細胞可被顯著感染，被感染比例比疫苗組高，PBMC也幾乎未被感染這與疫苗

15、免疫組的結果相同。據(jù)此推測疫苗株HuN4-F112由于感染PAM和胸腺細胞效率的下降導致在體內疫苗毒力的降低，但其仍能在扁桃體中復制，從而能刺激機體產(chǎn)生免疫反應，發(fā)揮免疫保護作用。
　　本研究確定了影響PRRSV疫苗株HuN4-F112在PAM上復制效率的關鍵基因，可能部分揭示了該疫苗株致弱的分子機理，對PRRSV的基礎研究及下一代疫苗的開發(fā)具有重要的意義;此外本研究還確定了PRRSV儲存和復制的主要場所扁桃體，對研究PRRSV持