新鮮蓮子殼中黃酮的結(jié)構(gòu)鑒定、抗氧化活性及抗腫瘤活性評(píng)價(jià).pdf

1、蓮子中含有促進(jìn)健康的營(yíng)養(yǎng)成分,其提取物(EFSENN)具有抗氧化和清除自由基活性。然而,對(duì)新鮮蓮子殼(FSENN)中黃酮類物質(zhì)的抗氧化活性、抗腫瘤活性及其結(jié)構(gòu)鑒定鮮見(jiàn)報(bào)道。本研究的主要目的是鑒定蓮子殼60％甲醇提取物(EFSENN)中的抗氧化活性組分,并鑒定其中一個(gè)組分中的黃酮類物質(zhì),了解其結(jié)構(gòu)和抗腫瘤活性。在這里,結(jié)合了現(xiàn)代分析技術(shù)、生物技術(shù)以及分子生物學(xué)來(lái)研究從EFSENN分離得到的黃酮類物質(zhì)的結(jié)構(gòu)和生物活性。主要結(jié)果如下:

2、　　 1.黃酮提取和FSENN中的組分
　　 用60％的甲醇溶液從2000g蓮子殼中可以得到25g提取物(EFSENN),EFSENN用Toyopearl HW-40S進(jìn)行分級(jí),得到三個(gè)組分,分別為Fr1(130 mg),Fr2(1.8 g)和Fr3(200 mg)。采用Folin-Ciocalteu方法來(lái)測(cè)定組分中總酚的含量,Fr3中的總酚含量(相當(dāng)于872.87mg沒(méi)食子酸/g)比Fr2和Fr1高,其分別為768.11和1

3、38.75mg沒(méi)食子酸/g。
　　 2.鑒定EFSENN中Fr2的黃酮苷元種類及其含量
　　 利用HPLC-UV來(lái)確定從EFSENN分離得到Fr2中的苷元組成:通過(guò)與已有的標(biāo)準(zhǔn)品比對(duì),可以知道Fr2中含有四種苷元,分別為楊梅黃酮,槲皮素,山奈酚和異鼠李素；通過(guò)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線來(lái)測(cè)定這四種苷元在Fr2中的含量,其中槲皮素(10.2mg/g干重)高于異鼠李素(6.2 mg/g干重),其次是山奈酚(2.8 mg/g of干重)和楊

4、梅黃酮(0.4 me,/g干重)。
　　 3.LC/UV/MS分析
　　 利用LC/UV/MS在線分析Fr2中的黃酮的成分。在負(fù)離子模式下得到的有效信息,包括分子量、苷元以及糖基組成,進(jìn)而分析得到六種糖基化組分。通過(guò)以下信息可以推斷出峰1為楊梅黃酮-脫氧己糖:其準(zhǔn)分子離子峰m/z[M-H]-為479,苷元離子峰m/z[A-H]-為316.9,A環(huán)碎裂為碎片離子m/z150.9和其他碎片離子270.9兩部分。通過(guò)與蘆丁標(biāo)準(zhǔn)

5、品對(duì)照可以推出峰2是蘆丁(609 m/z)。峰3是槲皮素.脫氧己糖,其準(zhǔn)分子離子峰m/z[M-H]-為463,而其二級(jí)質(zhì)譜峰為at m/z300.9。通過(guò)以下信息可以推斷出峰4是山奈酚.單六碳糖.單六碳糖:其m/z[M-H]-為593,而二級(jí)質(zhì)譜m/z[A-H]-為285。峰5為異鼠李素-單六碳糖-單六碳糖,其準(zhǔn)分子離子峰m/z[M-H]-為623,而二級(jí)質(zhì)譜[A-H]-315的進(jìn)一步碎片離子為m/z270.9和m/z254.9。通過(guò)分

6、子離子峰m/z[M.H]-為477,以及碎片離子m/z[A-H]-為315和A環(huán)裂解的兩個(gè)碎片離子m/z150.8和m/z270.9,可以推斷出峰6為異鼠李素.脫氧己糖；通過(guò)分子離子峰m/z[M-H]-301,以及其二級(jí)碎片離子m/z178.9、m/z150.8和m/z106.9可以推出峰7為槲皮素。
　　 4.EFSENN中組分的抗氧化活性
　　 通過(guò)DPPH自由基清除實(shí)驗(yàn)、β-胡蘿卜素漂白方法分析、鐵離子還原實(shí)驗(yàn)和總

7、抗氧化能力的測(cè)定等體外抗氧化(T-AOC)實(shí)驗(yàn)來(lái)評(píng)價(jià)其抗氧化活性。采用CuSO4-Phen-Vc-H2O2-DNA化學(xué)發(fā)光法測(cè)定組分在抑制DNA氧化損傷的作用；在體外,通過(guò)化學(xué)發(fā)光方法測(cè)定組分清除羥基自由基(CuSO4-Phen-Vc-H2O2 system)和過(guò)氧化氫(luminol-H2O2 system)的能力；比較分析得出,Fr3清除DPPH自由基的能力最大,其在β-胡蘿卜素漂白實(shí)驗(yàn)中顯示出最強(qiáng)的抗氧化能力,然后依次是Fr2和F

8、r1；從我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果中可以得知,這幾個(gè)組分都有顯著的使鐵離子還原成亞鐵離子的能力；組分的總抗氧化能力從32.4到113.4U/mg,其中以Fr2的最強(qiáng)；其次是Fr3和Fr1；結(jié)果顯示Fr3在抑制DNA損傷作用的能力比Fr2和Fr1高,其IC50分別為5±0.85,8.3±0.09和46.2±0.13μg/mL:Fr2清除羥基自由基的IC50(40±0.14μg/mL)是最小,依次是Fr3和Fr1；在清除過(guò)氧化氫實(shí)驗(yàn)中,Fr2和Fr3的

9、能力相同(0.62μg/mL)。
　　 5.體外抗腫瘤活性研究
　　 Fr2的體外抗腫瘤活性是通過(guò)MTT法來(lái)測(cè)定組分對(duì)HeLa細(xì)胞的毒性作用,然后通過(guò)流式細(xì)胞儀和免疫印跡等來(lái)確定其抗腫瘤活性,MTT結(jié)果表明樣品存在良好的劑量.效果關(guān)系,其IC50μg/mL,為50μg/mL,在樣品濃度為200μg/mL時(shí),能最大抑制細(xì)胞生長(zhǎng)(>90％)。用濃度為150μg/mL的樣品處理細(xì)胞,其G2/M分裂期遞增15.96±0.59％。