Rassf10基因啟動子區(qū)甲基化在結直腸癌中的研究.pdf

1、背景結直腸癌(colorectal cancer，CRC)是常見的惡性腫瘤之一，在世界范圍內位于癌癥相關死亡原因第三位。全球每年大約有123萬例CRC患者被確診，嚴重威脅著人類的健康。結直腸癌的發(fā)病機制很復雜，研究表明其發(fā)生發(fā)展不僅涉及多基因的改變，而且還與表觀遺傳學的改變密切相關。多腫瘤抑制基因的表觀遺傳學失活，尤其是DNA甲基化，越來越受到人們的重視。近來研究發(fā)現Rassf基因家族表觀遺傳學失活在結直腸癌的發(fā)生中起重要作用。Rass

2、f(Ras association domain family)是Ras信號通路的負性調節(jié)基因家族，具有抑制腫瘤發(fā)生的作用，包括Rassf1-10十個成員，其大多數成員都因啟動子區(qū)甲基化發(fā)生表達缺失而在多種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中起到重要作用。文獻報導Rassf10基因在胃癌、甲狀腺癌、惡性黑色素瘤、兒童急性淋巴細胞白血病及前列腺癌中存在頻繁甲基化，是潛在的候選抑癌基因。但在結直腸癌中未見類似報道，Rassf10在結直腸癌中的甲基化狀態(tài)尚不清

3、楚。
　　目的：本研究旨在檢測Rassf10在結直腸癌及結直腸癌細胞系中的表達及甲基化情況，在轉錄水平研究其mRNA表達與啟動子區(qū)甲基化的關系，并應用SPSS17.0統(tǒng)計軟件分析Rassf10甲基化和結直腸癌臨床指征的關系，探討Rassf10在結直腸癌發(fā)生發(fā)展中的作用，為結直腸癌的診斷和治療提供新的思路和靶點。
　　方法：本課題選用了7株結直腸癌細胞系，分別是:LOVO、RKO、DLD1、HCT116、HT29、SW620和

4、SW480。應用甲基化特異性PCR(MSP)檢測結直腸癌細胞系中Rassf10基因啟動子區(qū)甲基化情況，采用半定量逆轉錄PCR(RT-PCR)方法檢測甲基轉移酶抑制劑5-aza-2-deoxycytidine(5-aza-dc)處理前后Rassf10在mRNA水平的表達變化，探討其表達是否受啟動子區(qū)甲基化調控。應用免疫組織化學和MSP等方法檢測結直腸癌組織標本中Rassf10的表達及甲基化情況，結合臨床資料，運用統(tǒng)計軟件對相關數據進行統(tǒng)計

5、學分析，探討Rassf10在結直腸癌發(fā)生發(fā)展中的可能作用。
　　結果：
　　1.應用甲基化特異性PCR檢測7株細胞系LOVO、RKO、DLD1、HCT116、HT29、SW620和SW480的甲基化狀態(tài)，發(fā)現LOVO、RKO和HCT116中Rassf10存在完全甲基化改變，余呈部分甲基化改變。
　　2.半定量逆轉錄PCR技術檢測以上7株結直腸癌細胞去甲基化藥物5-aza-dc處理前后Rassf10mRNA水平變化，發(fā)現

6、在LOVO、RKO和HCT116中Rassf10mRNA不表達，經5-aza-dc處理后恢復表達，HT29、SW480和SW620處理后Rassf10mRNA表達水平增加。結合MSP結果提示Rassf10在結直腸癌中因啟動子區(qū)甲基化表達下調。
　　3.20例配對結直腸癌與癌旁組織免疫組化結果顯示Rassf10在結直腸癌組織中的表達明顯低于癌旁組織，統(tǒng)計分析顯示差異有統(tǒng)計學意義。
　　4.在90例人結直腸癌組織中，Rassf1

7、0甲基化率為60％（54/90例），而在正常結直腸組織中均未見甲基化改變（0/10例）。Rassf10啟動子區(qū)甲基化與患者的性別、年齡及腫瘤組織分化程度無明顯相關性（P＞0.05），而與腫瘤分級及淋巴結轉移有一定的相關性(P＜0.05)，腫瘤分級Ⅲ-Ⅳ期較Ⅰ-Ⅱ期的患者甲基化率明顯高，而有淋巴結轉移的患者較無淋巴結轉移的患者Rassf10甲基化率明顯高。
　　結論：
　　1.Rassf10啟動子區(qū)在結直腸癌中存在異常高甲基化