木疏膠囊抗肝纖維化的動物研究和臨床觀察.pdf

1、[研究背景與目的] 肝纖維化是指肝細胞發(fā)生壞死及炎癥刺激時，肝臟中細胞外基質(extracelluarmatrix，ECM)的增生與降解失去平衡，從而導致肝臟內纖維結締組織異常沉積的病理過程，是慢性肝病向肝硬化發(fā)展的必經之路。近年來明確提出了肝纖維化完全有可能發(fā)生逆轉，因而，肝纖維化的研究已成為世界肝病研究領域的熱點課題。中醫(yī)藥辨病與辨證相結合，多途徑，多層次，整體調控，在慢性肝病的治療中發(fā)揮著獨特的優(yōu)勢。 前期實驗已證

2、實木疏膠囊能明顯改善肝纖維化大鼠的肝功能，預防治療可降低血清纖維化相關酶，顯著改善肝組織病理學損害，有效地干預大鼠肝纖維化，并證明其機理可能與抗氧化、抑制肝臟TIMP-1表達而減少膠原合成，促進降解有關，本研究是在這樣的結論基礎上，從體液免疫和細胞免疫的角度研究木疏膠囊對實驗性肝纖維化大鼠免疫功能的調節(jié)作用，并通過分子生物學手段研究揭示其對肝纖維化相關因子基因表達的影響，進一步探討其抗纖維化機制，同時也觀察其臨床療效，從而為木疏膠囊的臨

3、床應用提供依據，以期為抗肝纖維化治療研究和臨床慢性肝病的防治提供新的選擇。 [實驗方法] 一、誘導大鼠肝纖維化模型 肝纖維化動物模型：造模各組于實驗第1天皮下注射40％CCL40.5ml/100g體重，以后每4d皮下注射40％CCL4油溶液0.3ml/100g體重，連續(xù)8周。Wister大鼠隨機分為正常對照組，模型對照組，木疏膠囊預防組和治療組，鱉甲軟肝片預防組和治療組。預防實驗造模同時正常對照組及模型對照組每天

4、蒸餾水灌胃，木疏膠囊預防組木疏膠囊3.125g/kg/d溶于5ml蒸餾水后，分2次灌胃，鱉甲軟肝片預防組鱉甲軟肝片0.625g/kg/d溶于5ml蒸餾水后，分2次灌胃，治療實驗于造模結束后正常對照組及模型對照組蒸餾水5ml/d，分2次灌胃，木疏膠囊治療組木疏膠囊3.125g/kg/d溶于蒸餾水5ml后，分2次灌胃，鱉甲軟肝片治療組鱉甲軟肝片0.625g/kg/d溶于5ml蒸餾水后，分2次灌胃，共4周。實驗結束取肝右葉相同部位組織HE染色

5、和Masson染色觀察肝組織病理改變。 二、木疏膠囊抗實驗性肝纖維化的免疫作用機制研究 放免法測定血清細胞因子IL-2、IL-6、IL-8及TNF-α，RT-PCR法檢測肝組織TNF-α基因表達，流式細胞術檢測血淋巴細胞CD4、CD8表達。 三、木疏膠囊對實驗性肝纖維化相關因子基因表達的影響 RT-PCR法檢測肝組織TGF-β1、α-SMA、Col-Ⅰ、Col-Ⅲ基因表達。 四、木疏膠囊治療肝纖維

6、化的臨床觀察 肝硬化患者服用木疏膠囊治療3個月，觀察用藥后體征、癥狀及實驗室指標的改變。 [實驗結果] 一、四氯化碳皮下注射誘導大鼠肝纖維化模型，病理證實與正常對照組大鼠差異有顯著性，模型成功。 二、木疏膠囊治療對肝纖維化大鼠血清IL-2、IL-6、IL-8及TNF-α影響的結果為：模型對照組與正常對照組比較，IL-2下降，IL-6、IL-8及TNF-α升高，均有顯著性差異(P＜0.01)；各用藥組與模型

7、對照組比較，IL-2升高，IL-6、IL-8及TNF-α下降，均有顯著性差異(P＜0.05或P＜0.01)；木疏膠囊預防組和治療組分別與鱉甲軟肝片預防組和治療組進行兩兩比較，對IL-2的升高作用及對IL-6的下降作用均無顯著性差異(P＞0.05)；對IL-8的降低作用木疏膠囊優(yōu)于鱉甲軟肝片(P＜0.05)；對TNF-α的降低作用為木疏膠囊預防組優(yōu)于鱉甲軟肝片(P＜0.05)，而木疏膠囊治療組與鱉甲軟肝片無顯著性差異(P＞0.05)。

8、 三、木疏膠囊對肝纖維化大鼠肝組織TNF-α基因表達的影響結果為：模型對照組與空白對照組比較，升高均有顯著性差異(P＜0.01)；各用藥組與模型對照組比較，TNF-α基因表達下降，均有顯著性差異(P＜0.01)；木疏膠囊預防組和治療組分別與鱉甲軟肝片預防組和治療組進行兩兩比較，木疏膠囊預防組與鱉甲軟肝片使TNF-α基因表達下降的作用相當，均無顯著性差異(P＞0.05)；而木疏膠囊治療組使TNF-α基因表達下降的作用不及鱉甲軟肝片，均

9、有顯著性差異(P＜0.01或P＜0.05)。 四、木疏膠囊對肝纖維化大鼠血清CD4、CD8、CD4/CD8影響結果為：模型對照組與空白對照組比較，CD4、CD4/CD8下降均有顯著性差異，CD8下降無顯著性差異，但P值為0.052,非常接近具有顯著性差異的臨界值0.05；各用藥組與模型對照組比較，木疏膠囊預防組和治療組使CD4和CD4/CD8升高，均有顯著性差異(P＜0.05)，CD8升高，但無顯著性差異，鱉甲軟肝片預防組使CD

10、4升高，有顯著性差異(P＜0.05)，治療組無顯著性差異(P＞0.05)，鱉甲軟肝片使CD8和CD4/CD8升高，但均無顯著性差異(P＞0.05)；木疏膠囊預防組和治療組分別與鱉甲軟肝片預防組和治療組進行兩兩比較，顯示木疏膠囊與鱉甲軟肝片對CD4、CD8和CD4/CD8的升高作用相當，無顯著性差異(P＞0.05)。 五、木疏膠囊對肝纖維化大鼠肝組織TGF-β1、α-SMA、Col-Ⅰ、Col-Ⅲ基因表達的影響 模型對照組

11、與正常對照組比較，TGF-β1、α-SMA、Col-Ⅰ、Col-Ⅲ基因表達下降，均有顯著性差異(P＜0.01)；各組與模型對照組比較，TGF-β1、α-SMA、Col-Ⅰ、Col-Ⅲ基因表達升高，均有顯著性差異(P＜0.01)；木疏膠囊預防組和治療組分別與鱉甲軟肝片預防組和治療組進行兩兩比較，木疏膠囊降低TGF-β1、α-SMA、Col-Ⅰ、Col-Ⅲ基因表達的作用優(yōu)于鱉甲軟肝片，均有顯著性差異(P＜0.05或P＜0.01)。

12、六、木疏膠囊治療肝纖維化的臨床觀察 觀察木疏膠囊治療后患者食欲、腹脹、乏力、肝區(qū)不適應用Kendall's等級相關檢驗進行統(tǒng)計學分析，結果為均有明顯改善(P＜0.001或P＜0.05)；但肝區(qū)疼痛無明顯改善(P＞0.05)；白細胞和血紅蛋白較治療前升高，有統(tǒng)計學意義(P值=0.0196)；血清白蛋白治療前后比較結果(P值=0.0537)非常接近產生顯著統(tǒng)計學差異的臨界值；凝血酶原時間治療后較治療前縮短，有顯著性差異(P值=0.0

13、109)。 [結論] 1、木疏膠囊可升高肝纖維化大鼠血清IL-2，降低IL-6、IL-8、TNF-a水平，使肝纖維化大鼠肝組織TNF-α基因表達下降，對肝纖維化大鼠體液免疫功能有一定的調節(jié)作用。 2、木疏膠囊可使肝纖維化大鼠血清CD4、CD4/CD8升高，對肝纖維化大鼠細胞免疫功能有一定的調節(jié)作用。 3、木疏膠囊可降低肝纖維化大鼠肝組織TGF-β1、α-SMA、Col-Ⅰ、Col-Ⅲ基因表達，證明木疏膠囊