?；撬嵋种浦鲃?dòng)脈瓣膜間質(zhì)細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化的研究.pdf

1、第一章主動(dòng)脈瓣膜間質(zhì)細(xì)胞的分離、培養(yǎng)與表型鑒定
　　 目的:分離并培養(yǎng)出人主動(dòng)脈瓣膜間質(zhì)細(xì)胞，證實(shí)其表達(dá)?；撬徂D(zhuǎn)運(yùn)體并未被其他種類(lèi)細(xì)胞所污染，進(jìn)而為實(shí)驗(yàn)提供干預(yù)對(duì)象。
　　 方法:收集A型主動(dòng)脈夾層患者的主動(dòng)脈瓣葉（病檢排除微小的病變），用酶解法降解細(xì)胞外基質(zhì)，分離出瓣膜間質(zhì)細(xì)胞。免疫組化鑒定細(xì)胞的表型:?；撬徂D(zhuǎn)運(yùn)體，平滑肌α肌動(dòng)蛋白，波形蛋白，CD31，平滑肌肌球蛋白和結(jié)蛋白。
　　 結(jié)果:分離出的主動(dòng)脈瓣膜間

2、質(zhì)細(xì)胞能夠增殖，并表達(dá)?；撬徂D(zhuǎn)運(yùn)體，平滑肌α肌動(dòng)蛋白和波形蛋白，但不表達(dá)CD31，平滑肌肌球蛋白和結(jié)蛋白。
　　 結(jié)論:酶解法分離的人主動(dòng)脈瓣膜間質(zhì)細(xì)胞能夠在體外條件下增殖，并表達(dá)特有的表型，且未被內(nèi)皮細(xì)胞和肌細(xì)胞所污染。
　　 第二章建立主動(dòng)脈瓣膜間質(zhì)細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化的細(xì)胞模型
　　 目的:通過(guò)藥物干預(yù)建立主動(dòng)脈瓣膜間質(zhì)細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化的細(xì)胞模型。
　　 方法:對(duì)細(xì)胞使用鈣化培養(yǎng)基（含β甘油磷酸鈉，

3、地塞米松和維生素C）促進(jìn)主動(dòng)脈瓣膜間質(zhì)細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化。通過(guò)堿性磷酸酶活性檢測(cè)、染色和鈣化結(jié)節(jié)染色(yon Kossa法)以及western blot檢測(cè)堿性磷酸酶及Cbfαl的表達(dá)評(píng)估該模型的效果。
　　 結(jié)果:在藥物干預(yù)后的第21天，模型組較對(duì)照組的堿性磷酸酶活性、染色和鈣化結(jié)節(jié)染色更明顯，且表達(dá)更多的ALP和Cbfαl。
　　 結(jié)論:鈣化培養(yǎng)基能夠明顯地促進(jìn)主動(dòng)脈瓣膜間質(zhì)細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化，表達(dá)堿性磷酸酶和Cbf

4、αl并形成鈣化結(jié)節(jié)。
　　 第三章?；撬嵬ㄟ^(guò)ERK通路抑制主動(dòng)脈瓣膜間質(zhì)細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化
　　 目的:證實(shí)?；撬崮軌蛞种浦鲃?dòng)脈瓣膜間質(zhì)細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化，并討論牛磺酸轉(zhuǎn)運(yùn)體和ERK通路在其中扮演的角色。
　　 方法:在鈣化培養(yǎng)基中分別添加不同濃度的牛磺酸(1mM，3mM，5mM,10mM,20mM)，或?；撬?10mM)+ERK通路阻滯劑PD98059干預(yù)24小時(shí)后檢測(cè)核結(jié)合因子α-1的表達(dá)水平，在干預(yù)的第14

5、天和第21天分別檢測(cè)堿性磷酸酶的活性和表達(dá)水平。干預(yù)的第21天檢測(cè)鈣化結(jié)節(jié)和鈣含量，并檢測(cè)表型蛋白的變化。在培養(yǎng)基中添加?；撬?10mM)后，在不同時(shí)間(5min,10min,30min,60min,120min)檢測(cè)ERK通路的激活情況。在培養(yǎng)基中同時(shí)添加?；撬幔?0mM）和?；撬徂D(zhuǎn)運(yùn)體阻滯劑β丙氨酸/PD98059，干預(yù)20分鐘后檢測(cè)ERK通路的激活程度。
　　 結(jié)果:?；撬嵋詽舛纫蕾?lài)性抑制細(xì)胞產(chǎn)生核結(jié)合因子α-1和堿性磷酸