焦磷酸深度測序檢測HIV-1劣勢耐藥株方法的建立及初步應用.pdf

1、[目的]:
　　建立焦磷酸測序檢測HIV-1耐藥劣勢株平臺，利用該方法探究HIV耐藥劣勢株在中國HIV/AIDS初治且療效不佳患者中的流行數(shù)據(jù)及所起到的作用。
　　[方法]:
　　通過寡核苷酸標準品及人工合成序列對焦磷酸定量測序的線性、敏感性及穩(wěn)定性進行測定。對HIV-1基因組RT區(qū)的若干針對NRTIs及NNRTIs的重要耐藥突變位點設計包括PCR及焦磷酸測序引物，測序堿基分配順序等測序方案。研究對象以我國“十一五”H

2、IV/AIDS抗病毒治療隊列一（即初治患者）為基礎，選取其中病毒學治療失敗患者，取起始治療前血漿及部分病毒載量反彈后的血漿提取HIV-RNA，采用RT-PCR的方法對RT區(qū)基因進行擴增，使用焦磷酸測序方法對若干重要耐藥位點進行定量測序，比對患者在基線至病毒載量反彈的臨床數(shù)據(jù)信息(CD4+T淋巴細胞計數(shù)、HIV病毒載量、依從性及血藥濃度、常規(guī)測序序列)，進而探討焦磷酸測序進行劣勢耐藥株檢測對于HIV/AIDS患者臨床治療決策的意義和價值。

3、
　　[結果]:
　　1.通過標準品、人工合成K103N野生及突變型序列成功標定本實驗測序精度及線性，檢測敏感度最低可達1‰檢測線性經線性回歸，R2=0.9978。
　　2.設計針對NNRTI類及NRTI類藥物耐藥的8個位點（包括針對NNRTI類的K103N、Y181CIV;針對NRTI類的M184VI、D67N、K70ER、L210W、T215YF、K219QE等）及相關的PCR引物及測序引物和核苷酸分配序列。使用含

4、B型和AE型HIV病毒的血漿測試焦磷酸測序方案及上述8個位點，均獲成功。
　　3.對我國“十一五”HIV/AIDS抗病毒治療隊列一（即初治患者）患者的所有患者基線血漿標本進行常規(guī)耐藥檢測，選擇常規(guī)方法未檢出耐藥，但出現(xiàn)病毒學失敗的患者40例，對其基線血漿標本進行上述8個位點的焦磷酸測序。共檢測出劣勢耐藥突變19個，以K103N，Y181C出現(xiàn)頻率最高。
　　4.對出現(xiàn)病毒載量反彈的20例患者反彈后耐藥突變情況進行常規(guī)方法檢測

5、，其中5例焦磷酸檢測出的突變位點與反彈后突變位點相符。對部分患者進行多位點、多時間點標本進行焦磷酸測序和常規(guī)測序，觀察到劣勢耐藥株在藥物壓力下逐漸成為優(yōu)勢株、焦磷酸測序早于常規(guī)測序發(fā)現(xiàn)劣勢耐藥株等現(xiàn)象。
　　[結論]:
　　本研究在國內首次建立焦磷酸測序檢測HIV-1劣勢耐藥株的平臺，針對HIV-1的B及AE亞型的多個位點獨立設計、完善測序方法。從HIV/AIDS初治隊列中選擇基線常規(guī)測序無耐藥且病毒學治療失敗的患者進行基線