RUNX3對人胃癌細胞上皮-間質轉變(EMT)的影響分子機制研究.pdf

1、胃癌是目前人類最常見的惡性腫瘤，其死亡率占腫瘤相關死亡率的第二位。在我國，胃癌發(fā)病率高，預后差，導致胃癌患者死亡的主要原因是術后發(fā)生侵襲轉移，因此研究胃癌侵襲轉移的相關分子及其分子機制具有重要的理論價值和臨床意義。
　　 惡性腫瘤侵襲轉移的發(fā)生發(fā)展過程是一個復雜的生物學過程，包括腫瘤細胞從原發(fā)性病灶處分離，侵入周圍組織，穿透基底膜進入血管和淋巴管，滲出血管和淋巴管，重新形成轉移結節(jié)進而增殖成新的轉移灶，在此過程中上皮間質轉變(E

2、MT)和間質上皮轉變(MET)起到了關鍵的作用。EMT在胚胎發(fā)育過程中被發(fā)現(xiàn)，后來在眾多腫瘤轉移過程中也發(fā)現(xiàn)EMT的發(fā)生。EMT在正常胚胎發(fā)育過程中是受到時間和空間上嚴密調控的生物學過程，但在腫瘤中EMT的失調導致了上皮細胞失去了應有表型，獲得了間質細胞的特性，從而引起了腫瘤細胞的侵襲轉移，此過程中上皮標志性分子鈣粘蛋白E-cadherin表達降低，間質標志性分子波形蛋白Vimentin表達上升。臨床上胃癌發(fā)展過程中極易發(fā)生侵襲和轉移，

3、治療和預后情況極差，所以研究胃癌侵襲轉移及EMT的相關分子機制是診斷和治療胃癌的重要基礎。
　　 RUNX3是RUNX蛋白家族成員之一，RUNX3在胚胎發(fā)育過程中主要參與胃腸道的發(fā)育，神經發(fā)生等活動，近些年來研究發(fā)現(xiàn)RUNX3表達異常與胃癌的發(fā)生發(fā)展密切相關。Qing-LinLi等發(fā)現(xiàn)RUNX3可以通過對胃粘膜上皮細胞增殖的抑制，促進胃粘膜上皮細胞凋亡和細胞周期的停滯來調控胃粘膜上皮細胞的生長。臨床研究顯示:RUNX3也與胃癌的

4、侵襲轉移有關，但關于RUNX3影響胃癌侵襲轉移的分子機制還不完全清楚，RUNX3能否通過調控EMT影響胃癌的侵襲轉移目前還未見報道。本研究探討了腫瘤抑制因子RUNX3對人胃癌細胞EMT的影響及分子調控機制。
　　 第一部分:RUNX3對人胃癌細胞侵襲轉移的影響
　　 目的:探討RUNX3對人胃癌細胞BGC823及SGC7901侵襲轉移的影響。
　　 方法:將RUNX3的真核表達質粒轉染人胃癌細胞SGC7901及B

5、GC82348h后，一部分細胞提RNA和蛋白，做QRT-PCR和Westernblotting。另一部分細胞消化、計數(shù)，小室預鋪matrigel膠，取五萬個細胞加入Transwell小室的上層，下層加入NTH3T3細胞培養(yǎng)液，24小時后，移去上層未侵襲的細胞，穿過的細胞甲醇固定后結晶紫染色并細胞計數(shù)。
　　 結果:QRT-PCR和Westernblotting顯示在人胃癌細胞BGC823和SGC7901中RUNX3基因顯著高表達

6、，Transwell實驗中RUNX3高表達組相對于對照組侵襲到下層的細胞數(shù)顯著性減少。
　　 結論:轉染后RUNX3真核表達質粒成功高表達RUNX3蛋白。
　　 Transwell實驗表明在胃癌細胞系中高表達RUNX3組相對于對照組可以明顯抑制細胞的侵襲轉移性。
　　 第二部分:RUNX3對EMT相關基因表達的調控
　　 目的:探討RUNX3對EMT相關基因E-cadherin、Vimentin、Snai

7、l及Twist表達的影響。
　　 方法:將RUNX3的表達質粒轉染人胃癌細胞，提取RNA，反轉錄cDNA和提取蛋白，Westernblotting及RT-PCR、QRT-PCR檢測RUNX3對E-cadherin、Vimentin、Snail及Twist表達的影響，穩(wěn)定特異性siRNA干擾RUNX3的表達72小時后，檢測E-cadherin及Vimentin的表達。
　　 結果:RUNX3表達質粒轉染胃癌細胞SGC790

8、1后，Westernblotting顯示E-cadherin的蛋白水平有所升高，但不太明顯，Vimcntin的蛋白水平顯著降低。將RUNX3用siRNA干擾后，Vimentin的蛋白水平明顯升高，RT-PCR和QRT-PCR檢測結果發(fā)現(xiàn)Runx3對E-cadherin和Vimentin的RNA水平沒有顯著影響。高表達RUNX3后Snail和Twist等調控EMT的轉錄因子在蛋白和RNA水平上均沒有什么變化。
　　 結論:高表達R

9、UNX3只在蛋白水平上能夠輕微升高E-cadherin的表達，顯著抑制Vimentin的表達，沉默RUNX3后Vimentin顯著升高，但是RUNX3對EMT的調控作用與Snail和Twist等轉錄因子的調控無關，并且是一種轉錄后調控的作用方式。
　　 第三部分:Runx3調控Vimentin基因表達的分子機制
　　 目的:探討RUNX3對Vimentin基因的表達進行轉錄后調控的分子機制
　　 方法:轉染RUN

10、X3表達質粒后42h后，加入10μM的MG-132，作用6h后，提取蛋白，Westernboltting檢測Vimentin表達的情況，另外轉染RUNX3表達質粒后做microRNA基因芯片篩查，對篩查結果進行查閱文獻和microRNA數(shù)據(jù)庫比對分析。
　　 結果:加入蛋白酶體抑制劑MG-132后Vimentin的表達水平并沒有恢復。microRNA芯片結果顯示RUNX3可以顯著上調miR-30a的表達，查閱文獻和microRN

11、A數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)miR-30a可以不完全互補結合在Vimentin基因的3'-UTR區(qū)，抑制Vimentin蛋白的翻譯過程。
　　 結論:Runx3調控Vimentin的表達不是通過泛素-蛋白酶體途徑實現(xiàn)的，芯片結果顯示RUNX3可以上調miR-30a的表達，數(shù)據(jù)庫和文獻顯示miR-30a可以抑制Vimentin蛋白的轉錄后表達，從而說明RUNX3可以在轉錄后水平抑制Vimentin蛋白的表達。
　　 第四部分:RUNX3通

12、過miR-30a調控Vimentin基因表達影響EMT的發(fā)生
　　 目的:驗證RUNX3通過上調miR-30a從而抑制Vimentin基因的轉錄后表達這一分子機制。
　　 方法:轉染RUNX3表達質粒48h和siRNA干擾RUNX372h后，Trizol法提取RNA反轉錄成cDNA，QRT-PCR檢測miR-30家族的表達情況，miR-30家族mimics轉染胃癌細胞后提取蛋白，Westernboltting檢測Vime

13、ntin表達的情況。通過分子克隆構建了Vimentin的mRNA的3'UTR的熒光素酶報告質粒的野生型和突變型pMIR-Vimentin3'UTR,pMIR-Vimentin3'UTRMUT1和pMIR-Vimentin3'UTRMUT2，轉染miR-30a24h后轉染報告質粒，48h后進行熒光素酶檢測。
　　 結果:QRT-PCR結果證實:高表達RUNX3確實可以顯著升高miR-30a的水平，干擾RUNX3表達可以抑制miR-

14、30a的表達。RUNX3的變化對miR-30e沒有顯著性影響。miR-30amimics轉染胃癌細胞后Vimentin的表達水平顯著降低，和轉染RUNX3表達質粒的效果一致。miR-30e對Vimentin蛋白表達沒有影響。熒光素酶實驗顯示相對于轉染miR-1011，野生型和Mutl突變報告系統(tǒng)中轉染miR-30a熒光素酶表達值降低，Mut2突變報告系統(tǒng)中轉染miR-30a熒光素酶值恢復到對照組的水平。
　　 結論:RUNX3確

15、實可以顯著正性調控miR-30a的表達，但對miR-30e的調控不明顯，miR-30a可以靶向結合到Vimentin的3'UTR上的第二個結合位點上，抑制Vimentin的mRNA的翻譯，降低Vimentin蛋白的表達。腫瘤抑制因子RUNX3影響EMT的分子機制是RUNX3可以上調miR-30a的表達從而間接抑制了Vimentin的表達水平。
　　 研究創(chuàng)新性和意義
　　 腫瘤抑制因子RUNX3與惡性腫瘤的轉移有密切相關

16、性，本研究在細胞水平上首次揭示了在人胃癌細胞中RUNX3可以影響轉移過程中的上皮間質轉變(EMT)現(xiàn)象，并且證明RUNX3可以通過上調miR-30a的表達，miR-30a又通過靶向結合Vimentin的3，UTR，從而抑制EMT中關鍵的間質標志分子Vimentin的表達，從而起到抑制EMT的發(fā)生和胃癌細胞侵襲轉移的作用。通過此研究在RUNX3與EMT之間的關系上發(fā)現(xiàn)一個重要通路，并且在分子標志物方面對于胃癌的臨床診斷和治療提供重要的分子