氧化-抗氧化失衡在肺間質(zhì)纖維化形成及防治中的作用.pdf

1、間質(zhì)性肺疾病(ILD)是由200余種疾病組成的一類疾病，他們?cè)谂R床表現(xiàn)、實(shí)驗(yàn)室和病理學(xué)改變上具有一定的共同特點(diǎn)，但又有各自不同的特征。肺纖維化的典型病理學(xué)過(guò)程為肺泡上皮損傷，炎性細(xì)胞聚集，成纖維細(xì)胞過(guò)度增殖，細(xì)胞外基質(zhì)沉積，成纖維細(xì)胞增殖灶，以及蜂窩肺的形成。 博萊霉素可導(dǎo)致嚙齒類動(dòng)物急性肺損傷和肺纖維化，這一特點(diǎn)為研究肺間質(zhì)纖維化提供了成熟的動(dòng)物模型。最近研究表明，氧化/抗氧化失衡(即氧化應(yīng)激)可誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子核因子-кB(NF

2、-кB)的活化，具體機(jī)制尚不清楚。NF-кB是重要的轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)節(jié)許多炎癥性細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄，P65是其重要的功能亞單位。先前的研究顯示，在BLM誘導(dǎo)的肺間質(zhì)纖維化病理過(guò)程中，NF-кB的表達(dá)明顯增強(qiáng)。本研究旨在探討NF-кB的活化與氧化/抗氧化失衡的關(guān)系及其在肺間質(zhì)纖維化發(fā)病機(jī)制中的作用，并進(jìn)一步研究抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸(NAC)治療肺間質(zhì)纖維化的作用機(jī)制。 材料與方法 一、實(shí)驗(yàn)材料 1、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 8

3、周齡雌性C57BL/6小鼠體重17-20g，無(wú)特殊病原體SPF級(jí)(北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)公司)。 2、實(shí)驗(yàn)藥品 10％水合氯醛，博萊霉素(天津太河制藥有限公司)，N-乙酰半胱氨酸(海南贊邦制藥有限公司)。 3、實(shí)驗(yàn)試劑 NF-кBP65免疫組化試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)；P65 m-RNA原位雜交試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)；IL-4與TGF-β1酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)試劑盒(上

4、海森雄科技實(shí)業(yè)有限公司)；羥脯氨酸(HYP)、谷胱甘肽(GSH)與丙二醛(MDA)測(cè)定試劑盒(南京建成生物工程研究所)。 4、實(shí)驗(yàn)設(shè)備 紫外光、可見(jiàn)光連續(xù)分光光度計(jì)(法國(guó)S500-P)；全自動(dòng)酶標(biāo)儀(奧地利TECAN)；超聲勻漿機(jī)(德國(guó)UPH-200)。 二、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型的建立、分組與標(biāo)本處理 三、肺組織常規(guī)病理分析 1、常規(guī)病理肺組織經(jīng)不同濃度酒精常規(guī)脫水，制成5μm的肺組織石蠟切片，行HE染色

5、與Masson染色。 2、肺泡炎癥及纖維化程度的組織病理學(xué)評(píng)分方法依照Szapiel法確定肺泡炎癥及纖維化的程度，兩者均分4級(jí)，分別記為1、2、3、4分。 四、檢測(cè)指標(biāo)及方法 1、樣本用堿水解法測(cè)定肺組織羥脯氨酸HYP含量。 2、比色法測(cè)定肺組織及BALF中MDA、GSH及蛋白含量。 3、酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)法測(cè)定BALF中IL-4與TGF-β1含量。 4、免疫組化染色與原位雜交染

6、色法分別測(cè)定支氣管肺泡灌洗細(xì)胞P65蛋白及其m-RNA的表達(dá)。 5、觀測(cè)小鼠的體重變化。 五、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，所有數(shù)據(jù)均以x±s表示，計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果 一、三組小鼠肺組織病理結(jié)果肺組織病理HE染色顯示，模型組小鼠經(jīng)氣管注射博來(lái)霉素后7天，肺泡間隔增厚，肺泡腔內(nèi)可見(jiàn)滲出改變，內(nèi)有炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；14天時(shí)肺間質(zhì)大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，

7、肺泡間隔明顯增厚，可見(jiàn)多發(fā)片狀實(shí)變，Masson三色染色可見(jiàn)肺間質(zhì)內(nèi)有明顯的膠原沉積；第28天肺組織可見(jiàn)大片的實(shí)變，其間可見(jiàn)大量的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡結(jié)構(gòu)明顯喪失， Masson三色染色可見(jiàn)肺間質(zhì)大量的膠原沉積，正常的肺泡結(jié)構(gòu)明顯喪失，形成明顯的纖維化改變。與模型組小鼠相比，NAC治療組小鼠第7天肺泡炎明顯減輕，肺泡間隔略有增厚，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)較模型組明顯減輕；第28天可見(jiàn)肺實(shí)變程度較模型組明顯減輕，可見(jiàn)破壞的肺泡結(jié)構(gòu)，肺泡間隔增厚明顯，間

8、質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，有明顯膠原沉積。 二、三組小鼠肺泡炎癥及纖維化程度的病理學(xué)評(píng)分結(jié)果1、三組小鼠肺泡炎癥程度病理評(píng)分比較氣管注射博來(lái)霉素后7天與14天，BLM組小鼠肺泡炎癥評(píng)分為3.5±0.6與3.0±0.5，治療組小鼠肺泡炎癥評(píng)分為2.5±0.3與2.1±0.2，兩組間進(jìn)行比較的結(jié)果顯示，NAC明顯減輕了BLM誘導(dǎo)的肺泡炎癥程度(P<0.01)2、三組小鼠肺組織纖維化程度病理評(píng)分比較氣管注射博來(lái)霉素后，隨著實(shí)驗(yàn)時(shí)間的延

9、長(zhǎng)，BLM組與治療組小鼠肺組織纖維化程度逐漸加重。在注射博來(lái)霉素后28天，BLM組小鼠肺組織纖維化評(píng)分結(jié)果為3.8±0.5，肺纖維化程度最明顯，與治療組(2.2±0.6)比較的結(jié)果顯示，NAC明顯減輕了BLM誘導(dǎo)的肺組織纖維化程度(P<0.01)。 三、HYP含量的比較模型組小鼠第28天時(shí)的肺組織HYP含量為(696.5±41.2μg/g)，與對(duì)照組(348.0±22.6μg/g)比較，增長(zhǎng)了大約兩倍，兩者間有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(

10、P<0.01)。在注射博萊霉素后第7、14、28天，治療組HYP含量分別為450.6±27.1μg/g、520.3±22.8μg/g和575.6±23.4μg/g，雖分別較對(duì)照組明顯增加(P值分別為0.045，0.03和0.015)，但與相應(yīng)時(shí)間的模型組(分別為495.4±23.6μg/g，595.4±37.8μg/g和696.5±41.2μg/g)比較，HYP含量分別顯著降低(P值分別為0.046，0.03和0.02)。這說(shuō)明NAC明

11、顯減輕了BLM誘導(dǎo)的肺間質(zhì)纖維化程度。 四、MDA、GSH的含量 1、肺組織中GSH與MDA的含量(1)肺組織中GSH含量氣管注射BLM后7天，模型組小鼠肺組織GSH水平(86.2±10mg/gprot)與對(duì)照組(130.3±12mg/gprot)比較，明顯降低(P<0.01)，而治療組小鼠肺組織GSH水平為135.2±15mg/gprot明顯高于模型組，兩組間有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；28天時(shí)模型組小鼠肺組織

12、GSH含量仍低于正常對(duì)照組，但兩者間無(wú)顯著性差異。 (2)肺組織中MDA含量氣管注射BLM后，模型組小鼠肺組織MDA水平逐漸升高，7天時(shí)達(dá)峰值，為2.73±0.41 nmol/mgprot，與對(duì)照組(1.1±0.2nmol/mgprot)比較有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)；而7天時(shí)治療組小鼠肺組織MDA含量為1.91±0.36nmol/mgprot，較模型組下降，兩者間有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；14天和28天時(shí)兩組MDA水

13、平均逐漸下降并接近正常。 2、BALF中MDA與GSH的含量 五、支氣管肺泡灌洗細(xì)胞P65免疫組化染色與P65 m-RNA原位雜交染色結(jié)果 六、MDA、6SH與P65的相關(guān)分析 七、BALF中IL-4與TGF-β1的含量 八、三組小鼠的體重變化模型組與治療組小鼠的體重從氣管注射博萊霉素后第3天開(kāi)始明顯下降，7天時(shí)下降最明顯，以后體重逐漸增加，而對(duì)照組小鼠體重在實(shí)驗(yàn)期間一直增加。在氣管注射博萊霉素第

14、7、14、28天，模型組小鼠體重分別為15.7±0.29g、17.5±0.5g和20.2±0.29g，治療組小鼠體重分別為17.5±0.5g、19.7±0.29g和22.5±0.5g，對(duì)照組小鼠體重分別為20±0.5g、22±0.5g和23.5±0.5g，模型組和治療組體重均低于對(duì)照組(P值均小于0.05)，而模型組與治療組相比，對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)體重明顯降低(t值分別為-5.5、-6.5和-7；P值分別為0.01、0.007和0.006)，這

15、說(shuō)明NAC抑制了BLM造成的小鼠體重降低。 結(jié)論 1、氧化/抗氧化失衡參與了博萊霉素誘導(dǎo)的急性肺損傷和肺纖維化過(guò)程，并在病理過(guò)程中具有重要作用。 2、氧化/抗氧化失衡可能通過(guò)激活NF-кB，從而調(diào)節(jié)IL-4、TGF-β1等細(xì)胞因子釋放，進(jìn)而導(dǎo)致肺間質(zhì)纖維化的形成。 3、NAC在一定程度上可減輕博萊霉素所致的急性肺損傷和肺纖維化程度，其機(jī)制可能與NAC抑制NF—кB的活化，減少纖維化相關(guān)的細(xì)胞因子產(chǎn)生有關(guān)。