CIA動物模型中不同治療方案對Th17-Treg細胞及IL-17表達影響的實驗研究.pdf

1、目的: 類風濕關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid Arthritis,RA)是以關(guān)節(jié)炎癥和骨質(zhì)破壞為主要特征的自身免疫性疾病,致殘率很高,治療主要依賴于改善病情抗風濕藥物的聯(lián)合使用,目前臨床上常用的聯(lián)合方案很多,不同治療方案在RA患者中的療效不同,但這些聯(lián)合治療方案在RA治療中發(fā)揮作用的機制尚不完全清楚。近年來的研究已經(jīng)明確:Th17與Treg細胞之間的失衡是導(dǎo)致RA發(fā)病的重要機制。那么不同聯(lián)合治療方案在臨床上發(fā)揮不同的作用是否與其對 Th1

2、7與 Treg細胞平衡影響的不同呢?關(guān)于治療效果與Th17/Treg關(guān)系的研究較少,部分學者曾經(jīng)對部分單藥治療進行過研究。甲氨蝶呤(methotrexate,MTX)、柳氮磺吡啶(Sulfasalazin, SSZ)、硫酸羥氯喹(hydroxychloroquin, HCQ)、糖皮質(zhì)激素以及抗TNF-α的聯(lián)合治療是否可以調(diào)節(jié)Th17/Treg平衡以及哪種聯(lián)合方案能更好的調(diào)節(jié)Th17/Treg平衡目前尚無定論,在動物實驗與臨床試驗間亦存在

3、差異。本研究旨在了解臨床常規(guī)治療方案對外周血IL-17表達的影響,明確治療效果與Th17/Treg表達的關(guān)系,為制定更加有效的治療方案提供依據(jù)。本課題開展了RA動物模型的實驗研究,以闡明其聯(lián)合用藥機制。經(jīng) PUDMED、CNKI、萬方等檢索,國內(nèi)外尚未見有類似報道,為 RA的治療提供新思路和方法。本研究通過對RA動物模型,即膠原誘導(dǎo)的大鼠關(guān)節(jié)炎模型(collagen induced arthritis,CIA)的實驗研究,從炎性細胞因子

4、、T淋巴細胞亞群平衡與細胞凋亡的角度,研究臨床常規(guī)治療的作用機制。
　　方法: 建立Ⅱ型膠原誘導(dǎo)的雄性Wistar大鼠CIA模型,隨機分為CIA模型對照組、 MTX(2.7mg/kg/w)聯(lián)合潑尼松組(Pred:5mg/kg/day)、MTX(2.7mg/kg/w)聯(lián)合HCQ(40mg/kg/day)和SSZ(160mg/kg/day)、MTX(2.7mg/kg/w)聯(lián)合益賽普組(0.3mg/kg/day),另選8只健康大鼠作為正

5、常對照組。進行21周體內(nèi)實驗,初次免疫后第3周開始給藥。治療過程中連續(xù)對大鼠的關(guān)節(jié)炎癥程度進行評分,測量右后肢的踝關(guān)節(jié)的腫脹程度。治療21周后全部動物處死,留取大鼠右后肢踝關(guān)節(jié),大鼠外周血2ml以及脾臟,大鼠踝關(guān)節(jié)經(jīng)固定、脫鈣、包埋后,制成切片,外周血經(jīng)離心留取血清,從脾臟中分離脾單核細胞。然后各組大鼠行 HE染色觀察踝關(guān)節(jié)滑膜的組織病理學改變,進一步通過酶聯(lián)免疫吸附方法測定血清IL-17的水平,同時采用流式細胞技術(shù)檢測Th17及Tre

6、g細胞亞群的數(shù)量及其凋亡。
　　結(jié)果:
　　1.CIA大鼠造模成功率達90.3％(56/62)。
　　2.關(guān)節(jié)炎指數(shù)(AI):各治療組AI較模型對照組均有明顯改善,MTX聯(lián)合潑尼松組優(yōu)于MTX聯(lián)合羥氯喹和柳氮磺吡啶組及MTX聯(lián)合益賽普組(P<0.05),
　　3.踝關(guān)節(jié)腫脹程度:在三個治療組中,MTX聯(lián)合潑尼松組的踝關(guān)節(jié)腫脹程度改善最明顯(P<0.05)。
　　4.體重:MTX聯(lián)合潑尼松組體重較其它各組明顯

7、減輕(P<0.05)。
　　5.踝關(guān)節(jié)病理:CIA模型組大鼠的大量炎性細胞浸潤,滑膜增生,排列紊亂,軟骨、骨組織嚴重侵蝕; MTX聯(lián)合羥氯喹和柳氮磺吡啶組滑膜炎癥、軟骨及骨組織侵蝕有所減輕(P<0.05); MTX聯(lián)合潑尼松組和MTX聯(lián)合益賽普組滑膜炎癥、軟骨及骨組織侵蝕明顯改善(P<0.05)。
　　6.血清IL-17水平在CIA模型對照組大鼠中水平最高,各治療組大鼠的IL-17水平均較對照組大鼠明顯降低(P<0.05)。

8、
　　7. Th17及Treg細胞亞群:
　　(1)在免疫后第10周,各治療組大鼠脾Treg細胞亞群數(shù)量較CIA模型對照組增加,同時Treg細胞凋亡減低,各組間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
　　(2)在免疫后第21周,各治療組大鼠脾Th17細胞亞群數(shù)量較CIA模型對照組減少,各組間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。MTX聯(lián)合羥氯喹和柳氮磺吡啶組的Th17細胞亞群數(shù)量低于MTX聯(lián)合潑尼松組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0

9、.05)。
　　結(jié)論:
　　1.在CIA大鼠模型中:血清IL-17水平增高;Th17細胞亞群增多,凋亡減少, Treg細胞亞群減少,凋亡增多,存在Th17與Treg細胞之間的失衡。
　　2. MTX聯(lián)合潑尼松治療方案在改善關(guān)節(jié)炎指數(shù),踝關(guān)節(jié)腫脹度,抑制血清IL-17水平,調(diào)節(jié)Th17/Treg平衡等方面療效顯著,但是比較容易導(dǎo)致骨質(zhì)疏松,體重減輕。
　　3.甲氨蝶呤聯(lián)合羥氯喹、柳氮磺吡啶治療方案在改善關(guān)節(jié)炎指數(shù),

10、踝關(guān)節(jié)腫脹度等方面的作用相對較弱,它可以抑制血清IL-17水平、降低Th17細胞亞群的數(shù)量,同時增加Treg細胞亞群的數(shù)量,調(diào)節(jié)Th17/Treg的平衡可能是其發(fā)揮療效的機制。
　　4.甲氨蝶呤聯(lián)合益賽普治療可以抑制血清IL-17水平,同時減少Treg細胞亞群的凋亡,很可能通過調(diào)節(jié)Th17/Treg之間的平衡而發(fā)揮其治療RA的作用。
　　5.各治療組均不通過促進Th17細胞亞群的凋亡來調(diào)節(jié)Th17/Treg的平衡而發(fā)揮治療R