碭山酥梨果實木質(zhì)素合成關鍵酶基因CAD和SAD克隆及表達分析.pdf

1、碭山酥梨原產(chǎn)于安徽省碭山，由于自然環(huán)境惡劣、品種退化、田間管理粗放等原因?qū)е缕涔麑嵤毎吭龆?，果實肉質(zhì)變粗，口感多渣，嚴重影響了碭山酥梨的食用品質(zhì)和經(jīng)濟價值。木質(zhì)素單體的合成及聚合在細胞壁沉積導致部分薄壁細胞木質(zhì)化，引起細胞次生壁加厚形成石細胞。石細胞的發(fā)育與木質(zhì)素的合成、轉運及沉積密切相關。肉桂醇脫氫酶(CAD)是木質(zhì)素生物合成過程中的一種關鍵酶，降低CAD活性有可能減少木質(zhì)素單體的合成，芥子醇脫氫酶(SAD)在木質(zhì)素合成中特異地

2、將芥子醛還原為芥子醇。本研究以碭山酥梨果實為材料，克隆碭山酥梨果實木質(zhì)素合成關鍵酶基因CAD和SAD，進行生物信息學分析。構建原核表達載體進行SDS-PAGE分析。分析PbCAD基因熒光定量表達分析。構建真核表達載體進行亞細胞定位分析。主要實驗結果如下：
　　1、利用RT-PCR技術和RACE技術，獲得了PbCAD基因和PbSAD基因的全長并分別命名為PbCAD和PbSAD，基因登錄號分別為KF268003和KF537783。Pb

3、CAD基因全長為1283bp，ORF閱讀框978bp，編碼325個氨基酸；PbSAD基因全長為1399bp，ORF閱讀框1089bp，編碼362個氨基酸。
　　2、生物信息學分析表明：PbCAD的等電點約為6.61，呈弱酸性，分子量約為35.6kDa，無明顯的跨膜結構和信號肽，存在特有的NADPH結合位點，具有表異構酶結構域，屬于依賴于NADPH的表異構酶/脫水酶家族的氧化還原酶。PbSAD等電點約為6.86，呈弱酸性，分子量約為

4、38.9kDa，PbSAD包含ADH_N結構域(醇脫氫酶GroES-like區(qū)域，主要是醇脫氫酶的催化部位)和ADH_zinc_N結構域(Zn結合區(qū)域)，該蛋白結構域證明PbSAD屬于醇脫氫酶蛋白。
　　3、原核表達結果顯示：成功構建了原核表達載體，PbCAD基因和PbSAD基因SDS-PAGE電泳顯示各檢測到與預期分子量大小相符的重組蛋白條帶，說明PbCAD基因和PbSAD基因在大腸桿菌中均得到有效表達。
　　4、熒光定量