人臍血內皮祖細胞的分離、培養(yǎng)和鑒定及改良凍融法脫細胞血管支架的建立.pdf

1、血管疾病是目前全球發(fā)病率最高的疾病之一，可由動脈粥樣硬化、創(chuàng)傷、血管瘤以及各種先天性異常等因素引起，而主要治療方法與手段是血管移植術。據(jù)統(tǒng)計，在美國每年欲進行移植血管行動脈旁路術就高達10萬例以上。因此，如何進一步擴大血管移植物的有效來源已經(jīng)成為人們高度關注的重要課題。目前，血管移植物的臨床來源，主要是異體或自體血管以及人工材料，雖然這些材料可以為諸多的病患進行修復血管提供有利的條件，甚至可以更好地延長病患的生命，但是遠期效果卻未達到預

2、期的理想程度。由于異體或是自體血管的移植分別存有組織相容性比較差，而自體動脈來源也有一定的限制等問題。而人工材料的應用也存在著一定的問題，小口徑(內徑小于6mm)的血管移植過程之中血管存在著不同程度的高張力、低血流的特殊狀態(tài)，在病患進行移植之后，其失敗率也較高。與此同時，這些人工血管不具備生長以及自我修復功能。組織工程血管，通常是利用細胞外基質作為血管支架，充分、有效地運用組織工程技術，將人工培養(yǎng)的血管內皮細胞種植于血管支架上，再通過相

3、關的技術手段，使之黏附、分化以及正常生長，同時分泌出ECM，從而構建出組織相容性較為良好、無免疫原性、更具較好的持久性與可塑性，且不易鈣化、感染、避免血栓形成的、具有生命力的血管替代物。本研究分為兩個部分：
　　第一部分：人臍血內皮祖細胞的分離、培養(yǎng)和鑒定。
　　目的：從嬰兒新鮮臍帶血中進行內皮祖細胞的分離，并對其進行科學的培養(yǎng)與鑒定。本文采用6％羥乙基淀粉沉降法和percoll非連續(xù)性密度梯度離心法，在新鮮人臍血中進行內皮

4、祖細胞（EPCs）分離，并將分離出的細胞純化，在體外進行進一步的培養(yǎng)和增殖。采用相關抗原免疫染色對所培養(yǎng)的人臍血內皮祖細胞進行鑒定。以進一步探尋簡化的實驗步驟，如何獲得足量內皮祖細胞的最佳實驗方法，并為實驗課題提供充足、健康的內皮祖細胞來源，為下一步實驗準備充足的細胞來源。同時，深入探討人臍血中分離并大量培養(yǎng)內皮祖細胞的可行性以及臨床應用價值。
　　方法：收集蚌埠醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科足月剖腹產(chǎn)手術胎兒臍帶血，無菌條件下放置于含

5、有50U/ml肝素的血清瓶中，放置于4℃冰盒中保存，運送至細胞培養(yǎng)室，采用密度梯度離心法來獲取臍帶血單個核細胞，將獲取的單個核細胞分成兩份，加入胎牛血清M199培養(yǎng)基（FCS-M199）及自體血清M199培養(yǎng)基（AS-M199），并分別將其接種于鋪設有人纖維連接蛋白（HFN）和未鋪設有人纖維連接蛋白的培養(yǎng)皿中（標記為：F(0)、F(1)、A(0)、A(1)）進一步進行體外誘導、分化以及擴增。并觀察貼壁細胞在整個誘導分化過程中的形態(tài)學變化

6、，結合免疫組化、免疫熒光以及流式細胞儀等相關技術從不同角度對其進行鑒定。
　　結果：⑴培養(yǎng)1~2d后，臍血單個核細胞開始出現(xiàn)貼壁。而在3d之后紡錘形狀開始出現(xiàn)，此后貼壁細胞數(shù)量逐漸增多，且逐漸變成梭形。當培養(yǎng)至一周時，則形成周圍為梭形細胞，而在中央是圓形細胞的典型集落。而在細胞培養(yǎng)至14d時，則出現(xiàn)了互相連接的細胞簇逐漸連接并形成網(wǎng)樣結構。與此同時，隨著培養(yǎng)時間的不斷增加，長梭形細胞也開始逐漸縮短，并呈典型鋪路石樣改變。⑵貼壁細胞

7、培養(yǎng)至一周之后繼續(xù)觀察，在鋪設有人纖維連接蛋白的培養(yǎng)基之內的細胞數(shù)量明顯較沒有鋪設人纖維連接蛋白的多，而在兩種不同培養(yǎng)基的細胞數(shù)量上無明顯變化。⑶免疫組化：單個核細胞培養(yǎng)至14d之后，貼壁細胞CD31通過FCS-M199培養(yǎng)后其陽性表達率為（88.95±7.23）%；vWF的陽性表達率為（75.01±9.42）%。AS-M199培養(yǎng)的細胞其CD31陽性表達率為(86.79±7.53)%，vWF的陽性表達率為(74.31±7.14)%。⑷

8、免疫熒光染色：細胞培養(yǎng)至第7d，細胞吞噬 DiI-acLDL（+），發(fā)出紅色熒光；結合 FITC-UEA-Ⅰ（+），發(fā)出綠色熒光；雙染（+）則呈黃色熒光。FCS-M199貼壁細胞雙染陽性率（86.56±6.81）%，AS-M199的貼壁細胞雙染陽性率（84.47±7.25）%。⑸流式細胞儀分析提示：第7天時所測定的貼壁細胞表面標志 CD133、CD34以及血管內皮細胞生長因子受體-2(VEGFR-2)分別為：（29.35±6.43）%、

9、（52.79±8.01）%、（80.67±6.82）%；而在20天時的分析顯示CD133陽性率為(1.52±0.32)%，CD34以及血管內皮細胞生長因子受體-2(VEGFR-2)表達率則分別為（61.48±7.65）%、（91.28±7.98）%。
　　結論：①通過密度梯度離心法從臍帶血分離單個核細胞，再用 VEGF、bFGF等因子誘導培養(yǎng)，以 VEGFR-2、CD133及 CD34為標志物進行檢測，可獲得較為純化的血管內皮祖細

10、胞。②加入人纖維連接蛋白之后可以有效促進內皮祖細胞貼壁，其細胞貼壁數(shù)量明顯多于未加入人纖維連接蛋白組。③自體血清 M199培養(yǎng)基（AS-M199）可替代胎牛血清M199培養(yǎng)基（FCS-M199）培養(yǎng) EPCs，并取得較佳效果。④CD133在第7天時高度表達，在第20天時基本不表達，我們認為此時血管內皮祖細胞向成熟的血管內皮細胞轉變。因此，CD133可作為內皮細胞與內皮祖細胞相鑒別的重要標志。
　　第二部分：改良凍融法脫細胞血管支架

11、的制備。
　　目的：改良傳統(tǒng)的凍融制備脫細胞血管支架的技術，并用組織學染色和電鏡觀察等方法分別對兩種不同方法制備的血管支架進行比較。以進一步尋找更安全有效的脫細胞的方法，找到一種操作簡便、滅菌效果確實、費用低廉、殘留低的脫細胞血管支架制備方法。簡化實驗步驟，并為血管組織工程實驗提供充足、健康的血管支架來源。
　　方法：集蚌埠醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科足月剖腹產(chǎn)手術胎兒臍帶，無菌條件下放置于含有PBS液的血清瓶中，放置于4℃冰盒

12、中保存，運送至細胞培養(yǎng)室，剔除臍靜脈表面的結締組織及血管外膜，PBS液清洗后，按下列3種方法制備材料：(1)傳統(tǒng)方法：放置15 ml塑料凍存管內，置4℃冰箱中預冷1小時，-80℃冰箱冷凍2h，37℃水浴復溫30min，上述凍融過程反復進行3次。(2)改良方法：放置15 ml塑料凍存管內，置4℃冰箱中預冷1小時，快速浸入-196℃液氮中20 min，取出標本放入含50 ml無菌蒸餾水100 ml的無菌瓶內，置于37℃的氣浴恒溫振蕩箱內，反

13、復振蕩，融化30min；同法進行3次，備檢測。(3)未處理：直接備檢測。
　　結果：⑴大體形態(tài)觀察：未處理組呈乳白色，管壁淡黃色，彈性良好無塌陷，管腔內表面光滑。傳統(tǒng)反復凍融法組材料顏色淺白，管壁稍有塌陷，管腔內表面光滑。改良反復凍融法組材料顏色淺白，管壁無明顯塌陷，管腔內表面光滑。三者在大體形態(tài)上無明顯外觀上區(qū)別。⑵HE染色：HE染色、觀察，未脫細胞血管壁全層細胞豐富，管腔內面內皮細胞呈單層排列，中層平滑肌細胞胞體細長呈極性排列

14、。傳統(tǒng)反復凍融法處理后的血管材料內皮細胞及中膜平滑肌細胞明顯變形，破碎；可見細胞核變形、濃染、碎裂等現(xiàn)象。改良反復凍融法處理后的血管材料管壁全層和管腔面無明顯細胞殘留。⑶Masson三色染色法：未處理組細胞豐富，膠原纖維結構保持完整。傳統(tǒng)反復凍融組細胞仍有部分殘留。改良反復凍融組細胞成分大部分被脫去，藍染的膠原纖維結構保持完整。⑷電鏡掃描結果：未處理組內膜完整，光滑，內皮細胞覆蓋完整。傳統(tǒng)反復凍融處理組內皮細胞斷裂，連續(xù)性中斷；內膜下膠