表達人血清白蛋白-C肽融合蛋白畢赤酵母工程菌的構建.pdf

1、C肽(C-Peptide,CP)是胰島素A鏈與B鏈之間的連接肽，近年來研究發(fā)現(xiàn)CP通過與細胞膜上G蛋白耦聯(lián)的受體結合，使Ca2+通道開放，激活Na+-K+-ATP酶活性和一氧化氮合酶的活性，增加血流量，擴張血管，從而改善糖尿病患者的腎臟、神經、微血管病變。為了加快CP的藥物化進展，提高CP在體內的半衰期，我們構建了人血清白蛋白(HSA)-CP融合蛋白，將其在畢赤酵母系統(tǒng)中進行表達，并對表達的融合蛋白進行了鑒定、活性分析和初步的分離純化。

2、 根據(jù)表達系統(tǒng)的密碼子偏好性優(yōu)化CP基因，PCR從T-CP質粒中擴增CP基因，酶切連接pBlue-HSA質粒(HSA1800bp)和CP(100bp)基因，構建pBlue-HSA-CP質粒。測序結果顯示得到的融合基因HSA-CP序列與預期一致。用EcoRI和NotI雙酶切重組質粒pBlue-HSA-CP，回收HSA-CP片段，插入分泌表達載體。pPIC9k中，構建表達載體pPIC9k-HSA-CP。表達載體pPIC9k-HSA-

3、CP經限制性內切酶分析和PCR驗證表明，融合基因已經成功的插入到載體pPIC9k中。 表達載體pPIC9k-HSA-CP經SalI線性化后電擊轉化畢赤酵母GS115，用MM和MD平板篩選Mut+轉化子，PCR鑒定后，用甲醇誘導搖瓶分泌表達。將表達量較高的重組子進行表達產物鑒定和活性分析，優(yōu)化誘導時間和誘導劑濃度后，對融合蛋白進行初步的分離純化。經G418篩選得到能耐受3mg/mLG418重組菌8株，進一步搖瓶誘導篩選得到兩株表達