雞堆型艾美耳球蟲(chóng)裂殖子單鏈抗體可變區(qū)基因文庫(kù)的構(gòu)建.pdf

1、雞球蟲(chóng)病對(duì)養(yǎng)雞業(yè)的危害程度十分嚴(yán)重，全世界每年因雞球蟲(chóng)病造成的損失超過(guò)20億美元。最近的研究證明主要由堆型艾美耳球蟲(chóng)感染引起的亞臨床型球蟲(chóng)病對(duì)養(yǎng)雞業(yè)造成的損失有時(shí)要比臨床型球蟲(chóng)病大的多，因此對(duì)堆型艾美耳球蟲(chóng)進(jìn)行專(zhuān)門(mén)詳盡的深入研究是非常必要的。本文建立了針對(duì)雞堆型艾美耳球蟲(chóng)裂殖子抗原的鼠源抗體基因文庫(kù)，并對(duì)其進(jìn)行了初步鑒定。 本試驗(yàn)利用單卵囊分離技術(shù)從雞場(chǎng)分離了四株純種艾美耳球蟲(chóng)卵囊，經(jīng)增殖純化后，提取卵囊基因組DNA，用特異性引

2、物進(jìn)行PCR擴(kuò)增鑒定，結(jié)果顯示其中兩株為純種雞堆型艾美耳球蟲(chóng)。將增殖的卵囊接種無(wú)球蟲(chóng)感染的健康雛雞，確定提取裂殖子的最佳時(shí)間為接種后56小時(shí)；并進(jìn)行第二代裂殖子的提取純化試驗(yàn)。純化的裂殖子經(jīng)超聲裂解，高速離心，取上清，得到裂殖子可溶性抗原。將提取的堆型艾美耳球蟲(chóng)裂殖子可溶性抗原與等量佐劑乳化，免疫BALB/C小鼠。采取免疫小鼠的血液，制各陽(yáng)性血清，應(yīng)用本實(shí)驗(yàn)室建立的間接ELISA方法檢測(cè)抗體效價(jià)，取抗體效價(jià)高的小鼠作為脾臟供體。提取脾臟

3、的總RNA，瓊脂糖凝膠電泳證明小鼠脾細(xì)胞總RNA提取成功。以提取的RNA為模板，利用引物Oligo(dT)<,15>合成cDNA。根據(jù)小鼠抗體可變區(qū)的恒定區(qū)的氨基酸序列設(shè)計(jì)合成擴(kuò)增鼠抗體輕鏈和重鏈可變區(qū)的兼并引物，并以cDNA為模板，擴(kuò)增出輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)基因。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)輕鏈可變區(qū)基因的大小約390bp，重鏈可變區(qū)基因在420bp左右。從瓊脂糖凝膠上切下所需DNA片段，用回收試劑盒回收輕鏈、重鏈可變區(qū)，經(jīng)瓊脂糖凝膠