草魚恒定鏈基因的克隆、分子特征及其與MHC分子關(guān)系的研究.pdf

1、恒定鏈（invariant chain，Ii）是一種非多態(tài)性II型跨膜糖蛋白，編碼的白細(xì)胞分化抗原為CD74，存在于多種細(xì)胞表面上。Ii鏈?zhǔn)荕HC II類分子的重要伴侶蛋白，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中輔助MHC II類分子進(jìn)行正確的折疊、組裝并與MHC II類分子聚合成(αβIi)3九聚體以及靶向內(nèi)體的轉(zhuǎn)運(yùn)，同時(shí)Ii鏈以其CLIP區(qū)(the class-IIassociated Ii chain peptide)占據(jù)MHC II類分子的抗原結(jié)合槽，從而

2、阻止內(nèi)源性抗原肽與MHC II類分子結(jié)合。 Ii鏈在MHC II類分子呈遞外源性抗原給CD4+T淋巴細(xì)胞的過程中起著關(guān)鍵性作用，對(duì)于機(jī)體的免疫應(yīng)答具有重要調(diào)節(jié)意義。目前基于Ii的核酸疫苗已得到相關(guān)應(yīng)用。
　　前，對(duì)于Ii鏈結(jié)構(gòu)與功能的研究主要集中在人等哺乳動(dòng)物以及禽類，而對(duì)魚類了解甚少。魚類處于生物鏈的底端。為研究魚類Ii鏈的結(jié)構(gòu)與功能，本實(shí)驗(yàn)首次獲得了草魚Ii鏈的基因序列，并對(duì)其生物信息學(xué)分析和結(jié)構(gòu)建模，同時(shí)對(duì)草魚Ii與MHC在

3、不同組織中的定量表達(dá)關(guān)系和細(xì)胞定位表達(dá)進(jìn)行了研究，最后制備了草魚恒定鏈的特異性抗體，為進(jìn)一步研究魚恒定鏈的結(jié)構(gòu)功能、進(jìn)化關(guān)系以及與主要組織相容性復(fù)合體的關(guān)系提供理論基礎(chǔ)。
　　第一，本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用RT-PCR和RACE法成功克隆了草魚魚Ii基因，經(jīng)測(cè)序和比對(duì)鑒定該草魚Ii的全長(zhǎng)大小為1116bp，編碼區(qū)的大小是711bp，含有236個(gè)氨基酸。
　　第二，利用生物信息學(xué)方法將草魚Ii鏈與其他物種的Ii鏈進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)草魚Ii鏈也包

4、括胞漿區(qū)、跨膜區(qū)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔區(qū)和甲狀蛋白（Tg）4個(gè)結(jié)構(gòu)域。根據(jù)推測(cè)的氨基酸序列，進(jìn)行不同種間Ii鏈的同源性進(jìn)化關(guān)系分析，發(fā)現(xiàn)草魚與鰱魚的親緣關(guān)系最近。應(yīng)用生物學(xué)相關(guān)軟件，將草魚Ii鏈與其他物種比較，構(gòu)建3D結(jié)構(gòu)模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)草魚與人、小鼠、雞、鵝和斑馬魚的Ii鏈在空間結(jié)構(gòu)上十分相似，甚至在一些位點(diǎn)上的氨基酸都是相同的。
　　第三，以18sRNA基因?yàn)閮?nèi)參基因，運(yùn)用相對(duì)熒光定量的方法檢測(cè)Ii與MHC在草魚十二種不同組織中的表達(dá)關(guān)系，

5、結(jié)果表明草魚Ii與MHC在組織中的表達(dá)呈正相關(guān)，同時(shí)還將Ii與MHC分別插入真核表達(dá)質(zhì)粒Pmcherry-C1和pEGFP-N1，轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，結(jié)果顯示它們分別定位于內(nèi)膜系統(tǒng)。
　　最后，原核表達(dá)草魚Ii，以純化的蛋白免疫小鼠制備了抗草魚Ii的多克隆抗體，并通過Western Blot驗(yàn)證了抗體的特異性，為研究Ii與MHC的相互作用提供一定基礎(chǔ)。
　　上述實(shí)驗(yàn)表明，作為重要免疫分子的Ii鏈，不僅在遺傳背景上而且在空間的結(jié)