SD大鼠骨髓造血干細胞體外定向誘導擴增DC和攜帶FasL基因的重組慢病毒載體感染SD大鼠DC的研究.pdf

1、目的:研究SD大鼠骨髓造血干細胞體外定向誘導擴增為樹突狀細胞(DC)的穩(wěn)定可靠的培養(yǎng)方法，并探討攜帶FasL基因的重組慢病毒載體感染該DC的效率和FasL蛋白的表達情況，為進一步研究轉FasL基因在同種異體器官移植中誘導免疫耐受和保護移植物奠定基礎。 方法: 1.SD大鼠骨髓造血干細胞體外定向誘導擴增培養(yǎng)DC：無菌手術取出雙側股骨和脛骨的骨髓，大鼠淋巴細胞分離液密度梯度分離出界面單核細胞，用RPMI-1640完全培養(yǎng)基調

2、整細胞濃度在1.5×10<'9>/L左右，于50ml的培養(yǎng)瓶中加入10ml的細胞懸液，加入rr-GM-CSF和rr-IL-4于37.0℃、5％的CO<,2>培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔一天半量換液并加rr-GM-CSF和rr-IL-4，培養(yǎng)兩周收集細胞鑒定。 2.攜帶FasL基因的重組慢病毒載體感染DC：使用不含抗生素，含10％FBS的DMEM培養(yǎng)基，將培養(yǎng)一周的細胞重鋪于六孔板中，每孔細胞數量為5×10<'5>，24小時后觀察，細胞適合

3、感染，按照MOI=10感染細胞，使用GFP陽性對照質粒作對照實驗，感染24小時后，培養(yǎng)皿中添加1ml新鮮培養(yǎng)基，每隔一天加細胞因子繼續(xù)培養(yǎng)，熒光顯微鏡觀察熒光強度和數量，添加病毒液后10天收集細胞進行實時定量檢測和WB檢測。 結果: 1.SD大鼠骨髓分離出的單核細胞培養(yǎng)兩周后，流式細胞儀(FCM)檢測細胞表面分子的陽性率MHC-Ⅱ為88.02％、CD86為62.82％、OX62為85.66％，經TNF-a刺激，陽性率MH

4、C-Ⅱ為93.41％、CD86為93.94％、OX62為94.10％；倒置顯微鏡及電鏡可見典型的DC形態(tài)；同種混合淋巴細胞反應(MLR)中能刺激初始T細胞進行增殖。 2. 攜帶FasL基因的重組慢病毒載體感染DC192小時(8d)后，細胞開始出現(xiàn)熒光，240小時(10d)感染效率為100％；實時定量PCR檢測瞬時轉染后目的基因的表達顯示以Cell的1.00％為參照，Cell+FasL Plasmid為167.03％：免疫印跡檢測

5、轉染后FasL蛋白的表達顯示以Cell的1.00％為參照，Cell+FasLPlasmid為34.15％。 結論:成功建立了SD大鼠骨髓造血干細胞體外定向誘導擴增DC的培養(yǎng)方法，通過形態(tài)學、分子表面標志和MIR等鑒定得到證實；攜帶FasL基因的重組慢病毒載體成功感染DC，實時定量PCR及Western blot證實感染的DC表達FasL明顯提高。為進一步研究轉FasL基因在同種異體器官移植中誘導免疫耐受和保護移植物奠定了理論和實