DNA去甲基化對絨山羊脂肪間充質干細胞特性和三胚層分化的影響.pdf

1、表觀遺傳標記的變化是決定干細胞命運和分化的重要調控因素。在過去的幾年里，表觀遺傳調控干細胞生物學的研究主要集中在胚胎干細胞(Embryonicstem cells，ESCs)。然而，對表觀遺傳調控成體干細胞生物學過程的理解卻很有限。間充質干細胞(Mensenchymal stem cells，MSCs)是研究最多的成體干細胞群體，但是對調節(jié)間充質干細胞的分化狀態(tài)和特性的分子機制的研究仍不成熟。由于脂肪間充質干細胞(Adipose-der

2、ived stem cells，ADSCs)取材容易、來源廣泛，成為近些年理論研究和臨床應用的首選材料。
　　本研究以特色優(yōu)質阿爾巴斯絨山羊的脂肪間充質干細胞作為研究對象，使用表觀遺傳試劑氮胞苷(5-azacytidine，5-Aza)和地西他濱（5-aza-2'-deoxycytidine，5-Aza-dC）體外改變脂肪間充質干細胞的表觀遺傳修飾，研究DNA去甲基化對脂肪間充質干細胞的特性和功能的調控作用，以便豐富表觀遺傳調控干

3、細胞分化的內容，為理解干細胞特性和功能的分子機制提供實驗依據。
　　一、表觀遺傳試劑對阿爾巴斯絨山羊脂肪間充質干細胞生長的影響
　　本研究通過細胞計數法、MTT法和流式細胞周期和凋亡檢測的結合發(fā)現，以半抑制濃度培養(yǎng)細胞24h時，雖然細胞周期阻斷在G0/G1期，但細胞凋亡數目較少，活性最強。
　　二、表觀遺傳試劑對阿爾巴斯絨山羊脂肪間充質干細胞去甲基化作用
　　我們使用半抑制濃度的5-Aza和5-Aza-dC分別培

4、養(yǎng)細胞24h，提取5-Aza和5-Aza-dC處理后的gADSCs基因組，檢測發(fā)現DNA甲基化水平降低，然而羥甲基化水平升高。5-Aza和5-Aza-dC對基因轉錄水平的影響是一致的，都引起DNMT1和DNMT3B基因轉錄抑制，DNMT3A、TET1、TET2和TET3基因轉錄升高。蛋白質水平上，gADSCs在5-Aza處理下，DNMT1表達量下降，TET1和TET3表達升高;5-Aza-dC處理后，雖然沒有抑制DNMT1表達，但是TE

5、T1、TET2和TET3蛋白表達升高。結果表明，雖然5-Aza和5-Aza-dC的作用機制略有不同，但是都引起了TET家族促進5-甲基胞嘧啶向5-羥甲基胞嘧啶發(fā)生轉換，基因組DNA發(fā)生很大程度的去甲基化。
　　三、DNA去甲基化對細胞增殖、凋亡和多能性相關基因表達的影響
　　細胞免疫熒光、實時定量PCR和蛋白質免疫印跡檢測5-Aza和5-Aza-dC處理前后的gADSCs中，增殖相關基因TERT和PCNA，凋亡相關基因P53

6、和BAX和多能性相關基因Nanog、 Oct4和Sox2的轉錄和表達的情況。研究發(fā)現，5-Aza和5-Aza-dC處理后的細胞中，Oct4、Sox2、TERT、PCNA和P53的轉錄水平均降低;在5-Aza處理后的細胞中，Nanog的轉錄水平升高，BAX的轉錄水平降低;在5-Aza-dC處理后的細胞中，Nanog的轉錄水平降低，BAX的轉錄水平升高。進一步地，5-Aza和5-Aza-dC處理提高了Sox2的表達，降低了PCNA的表達，而

7、BAX的表達升高。Nanog、Oct4、TERT和P53基因表達沒有變化。結果表明，基因組去甲基化改變了增殖、凋亡和多能性相關基因的轉錄水平。干細胞多能性的提高依賴于Sox2表達提高。
　　四、DNA去甲基化對gADSCs向三胚層分化的影響
　　通過檢測處理前后誘導形成的脂肪細胞分泌的脂滴含量和脂肪細胞特異性因子PPARG、Adipod、Fabp4和Leptin轉錄水平，發(fā)現處理后脂肪細胞的脂滴產量增加，PPARG轉錄水平降

8、低，Adipod、Fabp4和Leptin轉錄水平升高。ELISA檢測5-Aza和5-Aza-dC處理前后gADSCs分化形成的神經細胞中NGF含量，發(fā)現其含量增加。實時定量PCR結果顯示，處理后分化的神經細胞中ENO2和RBFOX3轉錄水平升高。通過檢測5-Aza和5-Aza-dC處理前后gADSCs分化形成的肝臟細胞中ALB和尿素含量、AFP轉錄水平，發(fā)現處理后ALB和尿素含量增加、AFP轉錄水平升高。這些結果表明，5-Aza和5-

9、Aza-dC處理促進了gADSCs向脂肪細胞、神經細胞和肝臟細胞分化。
　　五、DNA去甲基化對PPARG、RBFOX3和HNF4A啟動子甲基化水平的影響
　　實時定量PCR檢測發(fā)現，分化前5-Aza和5-Aza-dC改變了脂肪細胞、神經細胞、肝臟細胞分化相關的轉錄因子PPARG、RBOXF3和HNF4A的轉錄水平。亞硫酸氫鹽測序檢測PPARG、RBOXF3和HNF4A啟動子區(qū)域的甲基化水平發(fā)生改變。PPARG啟動子區(qū)域第8

10、1位CpG去甲基化位點、RBFOX3啟動子區(qū)域第8、20、44、70、174和181位CpG甲基化位點和HNF4A啟動子區(qū)域的4個CpG去甲基化位點對PPARG、RBFOX3和HNF4A的轉錄調控具有重要作用。
　　綜上研究得出，5-Aza和5-Aza-dC引起TET家族高表達促進5-甲基胞嘧啶向5-羥甲基胞嘧啶發(fā)生轉換，基因組DNA發(fā)生去甲基化;去甲基化使得不同基因的轉錄水平發(fā)生改變，但是卻依賴Sox2基因調控網絡促進gADSC