電針預處理通過EAAT2調節(jié)NDRG2誘導腦缺血耐受的研究.pdf

1、中風是世界第二大致死性第一大致殘性疾病。因此需要開發(fā)有效地治療手段來預防中風發(fā)生，同時減少缺血再灌注造成的損傷。電針是一種傳統(tǒng)醫(yī)學與現(xiàn)代電療結合的新的治療手段。由于針刺對于很多心腦疾患都有很好的療效，電針療法是對傳統(tǒng)針刺的一大提升。我們近年的研究顯示，電針能夠發(fā)揮預處理效應，誘導腦缺血耐受。隨后的機制研究顯示，電針的預處理效應涉及到許多信號通路，如提高抗氧化物活性、調節(jié)內源性大麻素系統(tǒng)以及抑制凋亡。腦內星形膠質細胞在缺血后第一個受到損傷

2、，并啟動級聯(lián)反應，影響神經元的轉歸。NDRG2表達于星形膠質細胞，并可能參與星形膠質細胞的功能調節(jié)，我們前期研究也證實NDRG2在腦缺血損傷后表達上調。但其在電針預處理誘導的腦缺血耐受中的作用以及上下游調節(jié)機制尚不清楚。本研究旨在探討NDRG2在電針預處理中的作用，并研究其上下游調節(jié)機制。
　　實驗一NDRG2在電針預處理誘導的腦缺血耐受作用的研究
　　目的：探討NDRG2在電針預處理誘導的腦缺血耐受中的作用
　　方法

3、：60只雄性SD大鼠，體重280-320g，隨機分為3組(n=20)：假手術組(Sham)：不插入栓線，其余處理同MCAO組；對照組(Con)：建立MCAO模型，再灌注24h后處死；EA組(EA)：單次電針刺激，刺激后2h行MCAO，再灌注后24h處死動物。動物處死后取材，用免疫熒光雙標法定性觀察NDRG2蛋白的細胞分布，WesternBlot定量檢測NDRG2蛋白表達，RT-PCR半定量測NDRG2mRNA表達，免疫熒光雙標法測NDR

4、G2的細胞定位，細胞凋亡用TUNEL法檢測。
　　結果：缺血再灌24h后，NDRG2表達上調且主要分布于缺血半影區(qū)的GFAP陽性細胞中，NDRG2mRNA的表達和蛋白表達趨勢一致。NDRG2在假手術組主要定位于星形膠質細胞的胞漿，單純缺血時則主要定位于胞核，電針預處理組NDRG2表達較缺血組減少，胞核與胞漿均存在定位。TUNEL與NDRG2雙標結果顯示：NDRG2信號與TUNEL陽性細胞存在共定位，電針預處理組缺血半暗區(qū)TUNEL

5、與NDRG2雙陽性細胞表達較缺血組減少。
　　結論：電針預處理通過逆轉NDRG2表達上調減少凋亡，從而誘導腦缺血耐受。
　　實驗二電針預處理通過EAAT2調節(jié)NDRG2表達的研究
　　目的：探討電針預處理是否通過EAAT2調節(jié)NDRG2表達
　　方法：100只雄性SD大鼠，體重280-320g，隨機分為5組(n=20)：假手術組(Sham)：不插入栓線，其余處理同MCAO組；單純缺血組(Con)：建立MCAO模型

6、，再灌注24h后處死；EA組(EA)：單次電針刺激，刺激后2h行MCAO，再灌注后24h處死動物；EAAT2激動劑(CXT)組；EAAT2抑制劑(DHK)組。再灌注后24h評價神經功能學評分及腦梗死容積，動物處死后取材，用免疫熒光雙標法定性觀察NDRG2蛋白的細胞分布，WesternBlot定量檢測EAAT2及NDRG2蛋白表達。
　　結果：CXT組神經功能學評分明顯優(yōu)于MCAO組，DHK組與MCAO組組間比較無顯著統(tǒng)計學差異。C

7、XT組腦梗死容積明顯小于MCAO組(P<0.01)，DHK組與MCAO組組間比較無顯著統(tǒng)計學差異。CXT組EAAT2表達高于MCAO組，DHK組與MCAO組組間比較無顯著統(tǒng)計學差異。CXT組NDRG2表達低于MCAO組，DHK組與MCAO組組間比較無顯著統(tǒng)計學差異。NDRG2主要分布于缺血半影區(qū)的GFAP陽性細胞中，在假手術組主要定位于星形膠質細胞的胞漿，MCAO時主要定位于胞核，電針預處理組胞核與胞漿均存在定位，CXT組主要表達于胞漿

8、，DHK組多表達于胞核。
　　結論：電針預處理可通過上調星形膠質細胞中EAAT2的表達，抑制NDRG2的上調，從而減輕腦缺血損傷。
　　實驗三2-AG通過NDRG2調節(jié)STAT3在腦缺血耐受中作用的研究
　　目的：探討2-AG通過NDRG2調節(jié)STAT3在腦缺血耐受中的作用
　　方法：培養(yǎng)原代星形膠質細胞細胞，構建氧糖剝奪OGD模型模擬腦缺血。細胞轉染pSRL-SIH1-H1-GFP后行OGD，對照組不施行OGD

9、，其余同實驗組。MTT及LDH檢測細胞活力，WesternBlot檢測NDRG2及STAT3表達。隨后轉染pSRL-CDH1-GFP細胞后加入2-AG行OGD，MTT及LDH檢測細胞活力，WesternBlot觀察NDRG2及STAT3表達。
　　結果：MTT及LDH結果顯示，ODG后星形膠質細胞活力較正常細胞降低，轉染pSRL-SIH1-H1-GFP組細胞活力與正常細胞無差異；與正常星形膠質細胞相比，OGD后NDRG2、pSTA

10、T3蛋白水平上調，而pSRL-SIH1-H1-GFP轉染組NDRG2、pSTAT3蛋白水平低于ODG組。2-AG組細胞活力比OGD組細胞活力高，pSRL-CDH1-GFP轉染細胞后，抑制了2-AG組的細胞生存；WesternBlot結果顯示，與OGD組相比，2-AG組NDRG2、pSTAT3表達下調，轉染pSRL-CDH1-GFP后，逆轉了2-AG對NDRG2、pSTAT3表達的抑制作用。
　　結論：2-AG通過減少NDRG2表達