重組納豆激酶多抗的制備及應用在家兔體內的藥代動力學研究.pdf

1、納豆激酶(Nattokinase，NK)是由納豆芽孢桿菌(Bacillus natto)分泌的一種具有強纖溶活性的絲氨酸蛋白酶。體內外實驗證明該酶能顯著溶解體內外血栓，明顯縮短纖維蛋白的溶解時間。納豆激酶經口服后可迅速入血，纖溶活性強，作用時間長，具有安全性好、口服有效等優(yōu)點。
　　 本實驗對來源于納豆芽孢桿菌的納豆激酶基因進行了以下幾個方面的研究工作：
　　 1.采用CTAB法從納豆芽孢桿菌中提取基因組DNA，聚合酶鏈

2、式反應(PCR)擴增獲得約1024bp的片段。將目的基因與pET-30a質粒分別用限制性內切酶EcoR I、Sal I雙酶切后，用T4DNA連接酶連接來構建重組表達載體。將鑒定后的重組表達載體轉化到大腸桿菌BL21(DE3)中，IPTG誘導表達，利用Ni2+親合層析純化目的蛋白，SDS-PAGE結果顯示表達產物分子量約為28KD。
　　 2.以純化的重組蛋白免疫家兔制備了納豆激酶多克隆抗體，經辛酸-硫酸銨法純化抗體，酶聯(lián)免疫吸附

3、試驗(ELISA)法測得抗體滴度約為1：8000，Westernblot結果顯示在約28KD處有一特異性條帶。方陣滴定法測得抗原最適包被濃度為20ug/ml。
　　 3.將純化后的納豆激酶抗體用辣根過氧化物酶標記，建立了雙抗體夾心酶聯(lián)免疫法來檢測納豆激酶濃度。以納豆激酶標準品制備了標準曲線，精密度試驗結果良好，回收率測定結果表明檢測方法的回收率約為91％～102％。
　　 4.采用酶聯(lián)免疫吸附反應法(ELISA)研究了納