水稻系統(tǒng)獲得抗性基因OsSRT2的克隆及功能分析.pdf

1、人們通過基因工程技術發(fā)掘了一批擁有一定針對性的抗病基因，這些基因可以作為一個復雜的基因防御體系保護水稻植株免于細菌、真菌、病毒以及線蟲病原菌的侵染?？共』蛟谥参矬w內編碼的產物可以特異性地識別不相容的病原體，引發(fā)一系列級聯反應，導致宿主發(fā)生抗病反應。一種小分子的植物激素—水楊酸（SA）在植物抗病過程中扮演著重要的作用。病原體應答性的水楊酸生物合成被認為是受到PAD4、EDS5以及SID2控制的。而PAD4、EDS5、SID2的病原誘導表

2、達在擬南芥中會被AtSRT2抑制,說明AtSRT2在調節(jié)SA合成方面有重要作用。水稻中含有AtSRT2的同源基因—OsSRT2，它們都屬于沉默信息調節(jié)因子2（Silent information regulator2，Sir2）蛋白。Sir2自首次在酵母中被克隆出來以來，其同源物在一些哺乳動物中被相繼被克隆，然而我們對植物中Sir2家族的作用卻知之甚少。
　　為了探究Sir2類型蛋白在水稻系統(tǒng)獲得抗性中所扮演的角色，我們研究了Os

3、SRT2的亞細胞定位情況；轉基因植株中的基因表達量及其與抗性誘導相關水楊酸含量的關系；轉基因植株對白葉枯病病菌的抗性情況等。具體如下：
　　1．從水稻日本晴cDNA中克隆出SAR信號途徑的關鍵基因OsSRT2，序列分析顯示該其基因 cDNA的全長為938 bp的OsSRT2基因編碼的蛋白質分子量Mw=34.56kD，等電點pI=8.76。與NCBI已登錄的水稻SRT2基因同源性為99％，蛋白質序列同源性100%，說明SRT2在物種

4、進化過程中核苷酸發(fā)生了同義突變，而蛋白質水平的進化較保守。
　　2.為了發(fā)現OsSRT2基因的作用部位，推測OsSRT2作用方式提供依據。通過基因槍，瞬時轉化35S-OsSRT2-GFP融合表達質粒到洋蔥表皮細胞，在熒光顯微鏡下檢測亞細胞定位情況，結果可見OsSRT2定位于細胞核內。
　　3.構建了OsSRT2的過量表達載體和RNAi干涉載體，通過農桿菌轉化技術導入水稻內，共記獲得9株T1代過表達陽性植株，8株T1代干涉陽性

5、植株。對獲得的轉基因植株T1代體內游離態(tài)水楊酸（SA）含量進行HPLC測定，OsSRT2過表達植株體內水楊酸的含量明顯低于對照；而OsSRT2RNAi植株體內自由態(tài)水楊酸的含量大約是對照的1.5倍。說明OsSRT2參與調節(jié)SA在植株體內的積累，抑制植株體內的SA含量，從而間接證明了OsSRT2參與SA介導的抗病信號過程。
　　4.對轉基因植株中目的基因的水楊酸誘導表達模式進行了分析，結果顯示，過表達植株中OsSRT2的含量高于野生

6、型兩倍多，在SA處理后有一定下降，但依舊維持在較高的水平。而干涉植株的OsSRT2的含量大約為野生型的1/2，在SA處理后也有一定下降，處于一個較低的表達水平。
　　5.在劍葉期分別對OsSRT2過表達，OsSRT2-RNAi及野生型的日本晴植株進行白葉枯病病原菌接種鑒定，結果顯示：OsSRT2-RNAi的抗病能力明顯提高，而OsSRT2過表達轉基因水稻水稻更易感病。
　　上述表明克隆的OsSRT2基因通過負調控作用與水稻的