RATS轉(zhuǎn)運(yùn)Bcr-Abl入核對(duì)K562細(xì)胞促凋亡和抑增殖的效應(yīng)研究.pdf

1、Bcr-Abl融合蛋白是慢性粒細(xì)胞白血病(chronic myeloid leukemia，CML)發(fā)病的重要因素。該蛋白只定位于細(xì)胞漿，通過激活抗凋亡信號(hào)顯著抑制細(xì)胞凋亡，誘導(dǎo)細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化。因此，我們?cè)O(shè)想通過雷帕霉素類似物核轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)（Rapamycin analog transport system，RATS）轉(zhuǎn)運(yùn)Bcr-Abl入核，利用Bcr-Abl組成性的激酶活性，誘導(dǎo)CML細(xì)胞的凋亡。
　　本課題通過構(gòu)建重組腺病毒Ad5

2、-FLAG-3NLS-FRB*(Ad5-FN3R)、野生型 Ad5-HA-2FKBP-ABD(Ad5-HF2A)和突變型Ad5-HA-2FKBP-ABD(Ad5-HF2ATM)，共感染K562細(xì)胞，在加入雷帕霉素類似物AP21967后，檢測(cè)目的蛋白FN3R、HF2A、HF2ATM和Bcr-Abl的定位變化及其引起的細(xì)胞增殖、凋亡效應(yīng)的改變，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。采取的主要實(shí)驗(yàn)方法如下:
　　1.重組腺病毒Ad5-FN3R、Ad5-H

3、F2A、Ad5-HF2ATM和Ad5-null的構(gòu)建與鑒定:將FLAG標(biāo)記的三段NLS(FLAG-3NLS)與突變修飾的雷帕霉素靶FRB結(jié)構(gòu)域(FRB*)通過重疊PCR拼接獲得目的基因FLAG-3NLS-FRB*(FN3R)，將其克隆入穿梭載體pAdTrack-CMV中。通過分步克隆，將HA、兩段FKBP、ABD或ABDTM（突變了ABD上結(jié)合Abl的三個(gè)重要氨基酸）等4個(gè)片段依次克隆入pAdTrack-CMV中。經(jīng)酶切和測(cè)序鑒定后，與

4、腺病毒骨架質(zhì)粒pAd5同源重組，在AD-293細(xì)胞中包裝、擴(kuò)增。PCR檢測(cè)目的基因在腺病毒液中的表達(dá)。Western blot檢測(cè)目的蛋白FN3R、HF2A和HF2ATM在AD-293細(xì)胞和K562細(xì)胞中的表達(dá)。
　　2.RATS轉(zhuǎn)運(yùn)Bcr-Abl入核前后目的蛋白FN3R、HF2A、HF2ATM和Bcr-Abl的定位研究:將重組腺病毒Ad5-FN3R和Ad5-HF2A（或突變對(duì)照Ad5-HF2ATM）共感染K562細(xì)胞，在加入雷帕

5、霉素類似物AP21967前后，免疫熒光檢測(cè)目的蛋白FN3R、HF2A、HF2ATM和Bcr-Abl在K562細(xì)胞中的定位。
　　3.RATS轉(zhuǎn)運(yùn)Bcr-Abl入核后對(duì)K562細(xì)胞增殖、凋亡相關(guān)效應(yīng)的影響:將重組腺病毒Ad5-FN3R和Ad5-HF2A(或突變對(duì)照Ad5-HF2ATM)共感染K562細(xì)胞，在加入AP21967后，用MTS法檢測(cè)細(xì)胞增殖;用瑞氏染色、DAPI染色和caspase3活性實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞凋亡。
　　通過以

6、上試驗(yàn)，得出以下結(jié)果和結(jié)論:
　　1.成功構(gòu)建了重組腺病毒Ad5-FN3R、Ad5-HF2A、Ad5-HF2ATM和Ad5-null，Western blot證實(shí)在AD-293細(xì)胞和K562細(xì)胞中成功表達(dá)出了目的蛋白。
　　2.RATS成功轉(zhuǎn)運(yùn)Bcr-Abl入核，免疫熒光證實(shí)在加入AP21967前，F(xiàn)N3R主要定位于細(xì)胞核，HF2A和HF2ATM主要定位于細(xì)胞漿，Bcr-Abl定位于細(xì)胞漿;在加入AP21967后，F(xiàn)N3R和