脫細(xì)胞同種異體肌腱復(fù)合人重組骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2重建兔前交叉韌帶的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、一、研究目的：
　　 前交叉韌帶斷裂是常見(jiàn)的運(yùn)動(dòng)損傷，斷裂后只有進(jìn)行替代物重建才能恢復(fù)關(guān)節(jié)的穩(wěn)定和功能。目前臨床上常用的韌帶替代物主要為自體韌帶(肌腱)、異體韌帶(肌腱)和人工材料移植物。上述三類重建材料都存在著諸多的弊端，無(wú)法成為臨床上理想的選擇。由于無(wú)供區(qū)的繼發(fā)損害，以及保存、取材技術(shù)的改進(jìn)，目前同種異體肌腱在臨床上取得了廣泛的應(yīng)用。同種異體肌腱植入體內(nèi)，愈合過(guò)程類似于自體肌腱，需經(jīng)歷組織壞死、血管化、細(xì)胞爬行替代、重塑四個(gè)

2、階段。與自體肌腱不同，同種異體肌腱移植后，腱細(xì)胞表面的糖蛋白的MHC-1型抗原引起宿主的免疫排斥反應(yīng)，免疫反應(yīng)將影響異體肌腱與宿主骨的整合過(guò)程，可以導(dǎo)致腱-骨界面愈合延遲和減弱，甚至移植失敗。肌腱的細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)主要由Ⅱ、Ⅲ型膠原蛋白組成，同種異體及異種個(gè)體之間的同一組織，其ECM得成分和結(jié)構(gòu)很相近，其自身的免疫原性低。脫細(xì)胞技術(shù)可以去除肌腱的免疫成分而保留細(xì)胞外成分原有的生物活性及力學(xué)特性。重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2具有很強(qiáng)的促進(jìn)

3、成骨細(xì)胞分化和誘導(dǎo)體外成骨的能力，已有試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)可促進(jìn)自體半腱肌重建ACL的腱骨愈合。本實(shí)驗(yàn)使用磷酸三丁酯(TBP)進(jìn)行脫細(xì)胞處理去除同種異體肌腱中的細(xì)胞成分，測(cè)定其對(duì)肌腱的組織學(xué)和力學(xué)特性的影響，脫細(xì)胞后的異體肌腱復(fù)合人重組骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2重建兔交叉韌帶，定期對(duì)重建的ACL進(jìn)行組織學(xué)觀察、影像學(xué)檢測(cè)及生物力學(xué)的檢測(cè)，了解脫細(xì)胞同種異體肌腱復(fù)合rh-BMP-2對(duì)ACL重建的影響。
　　 二、研究方法：
　　 (一)同種異

4、體肌腱的脫細(xì)胞處理
　　 取新西蘭兔的趾屈肌腱進(jìn)行脫細(xì)胞處理，使用磷酸三丁酯(TBP)進(jìn)行脫細(xì)胞。TBP法：1、低滲的10mmTris液(包括絲氨酸蛋白酶抑制劑+金屬蛋白酶抑制劑+青霉素/鏈霉素)保持36h；2、高滲鹽水+50mmTris液(包含1％辛基含苯氧基聚乙氧基乙醇+蛋白酶抑制劑)保持48h；3、Hank’s生理緩沖液進(jìn)行漂洗；4、1％磷酸三丁酯36h+50mm三羥甲基氨基甲烷48h；5、含有抗生素的硫酸鹽緩沖液沖洗+浸

5、泡。
　　 (二)脫細(xì)胞肌腱的組織學(xué)和生物力學(xué)測(cè)定
　　 對(duì)脫細(xì)胞處理的異體肌腱進(jìn)行HE染色、DAPI熒光染色檢測(cè)，觀察TBP脫細(xì)胞效果。使用二甲基亞甲藍(lán)(DMMB)法測(cè)定糖胺聚糖(GAG)含量，檢測(cè)脫細(xì)胞前后肌腱內(nèi)的GAG含量；使用動(dòng)物組織基因組DNA小量提取試劑盒測(cè)定DNA含量，檢測(cè)脫細(xì)胞前后肌腱的DNA含量變化；使用羥脯氨酸試劑盒測(cè)定羥脯氨酸含量，根據(jù)羥脯氨酸占膠原蛋白的含量，計(jì)算膠原蛋白含量，觀察脫細(xì)胞前后膠原蛋

6、白的變化；檢測(cè)肌腱的最大張力負(fù)荷和彈性模量，了解脫細(xì)胞處理對(duì)肌腱生物力學(xué)的影響。
　　 (三)脫細(xì)胞肌腱復(fù)合rh-BMP-2重建ACL的影像學(xué)觀察
　　 使用脫細(xì)胞肌腱重建兔前交叉韌帶，腱骨界面注入含rh-BMP-2的纖維蛋白凝膠，術(shù)后1、3、6月分別對(duì)患側(cè)膝關(guān)節(jié)骨隧道段進(jìn)行CT平掃，在矢狀位測(cè)量膝關(guān)節(jié)股骨、脛骨隧道的入口段、出口段及中間段的寬度，并與對(duì)照組進(jìn)行比較，了解脫細(xì)胞肌腱復(fù)合rh-BMP-2對(duì)促進(jìn)ACL重建后骨

7、隧道段的腱骨愈合的影像學(xué)變化。
　　 (四)脫細(xì)胞肌腱復(fù)合rh-BMP-2重建ACL的組織學(xué)觀察和力學(xué)特性檢測(cè)
　　 使用脫細(xì)胞肌腱重建兔前交叉韌帶，腱骨界面注入含rh-BMP-2的纖維蛋白凝膠，術(shù)后1、3、6月分別對(duì)患側(cè)膝關(guān)節(jié)骨隧道段、重建的ACL進(jìn)行硬組織切片、普通HE染色，觀察腱骨界面成骨情況及重建的ACL的炎癥反應(yīng)、細(xì)胞增殖等情況，并與對(duì)照組進(jìn)行比較；使用生物材料測(cè)試機(jī)對(duì)術(shù)后3、6月的膝關(guān)節(jié)標(biāo)本進(jìn)行ACL抗拔出試

8、驗(yàn)，記錄拔出的最大抗拉強(qiáng)度及彈性模量，了解脫細(xì)胞肌腱復(fù)合rh-BMP-2對(duì)ACL重建后腱骨愈合的影響。
　　 三、結(jié)果：
　　 (一)脫細(xì)胞肌腱的組織學(xué)和生物力學(xué)測(cè)定
　　 經(jīng)磷酸三丁酯(TBP)脫細(xì)胞處理的肌腱，HE染色未見(jiàn)細(xì)胞成分染色，DAPI熒光染色未見(jiàn)陽(yáng)性結(jié)果，提示細(xì)胞成分去除徹底；二甲基亞甲藍(lán)法測(cè)定糖胺聚糖含量，發(fā)現(xiàn)脫細(xì)胞前后對(duì)比無(wú)明顯差異；動(dòng)物組織基因組DNA小量提取試劑盒測(cè)定DNA含量，發(fā)現(xiàn)脫細(xì)胞前

9、后肌腱內(nèi)DNA含量明顯減少；使用羥脯氨酸試劑盒間接測(cè)定膠原蛋白含量，發(fā)現(xiàn)脫細(xì)胞前后膠原含量無(wú)明顯差異；生物力學(xué)測(cè)試發(fā)現(xiàn)，脫細(xì)胞前后肌腱的最大張力負(fù)荷和彈性模量無(wú)明顯差異。
　　 (二)脫細(xì)胞肌腱復(fù)合rh-BMP-2重建ACL的影像學(xué)觀察
　　 對(duì)ACL重建后的兔膝關(guān)節(jié)行CT平掃，可以較好地重建兔ACL重建模型的影像學(xué)情況。術(shù)后1月，兩組間骨隧道寬度對(duì)比無(wú)明顯差異；術(shù)后3月，脫細(xì)胞組骨隧道壁不光滑，存在成骨反應(yīng)，骨隧道寬度

10、與術(shù)后1月比較無(wú)明顯改變，而對(duì)照組未見(jiàn)成骨反應(yīng)，骨隧道寬度與術(shù)后1月相比，有增寬趨勢(shì)，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；術(shù)后6月，脫細(xì)胞組骨隧道壁成骨反應(yīng)較前增加，骨隧道寬度與術(shù)后1、3月略有增寬，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；而對(duì)照組仍無(wú)明顯成骨反應(yīng)，骨隧道寬度與術(shù)后1、3月相比，出現(xiàn)增寬現(xiàn)象，存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 (四)脫細(xì)胞肌腱復(fù)合rh-BMP-2重建ACL的組織學(xué)觀察和生物力學(xué)測(cè)試
　　 骨隧道段硬組織切片發(fā)現(xiàn)，術(shù)后1月，脫細(xì)胞組腱骨間隙較小

11、，可見(jiàn)少量Sharpey纖維及軟骨細(xì)胞生成，而對(duì)照組腱骨間隙寬大，無(wú)Sharpey纖維及軟骨細(xì)胞生成；術(shù)后3月，脫細(xì)胞組腱骨間隙進(jìn)一步減小，Sharpey纖維及軟骨細(xì)胞生成增多；而對(duì)照組腱骨間隙較前減小，少量Sharpey纖維及軟骨細(xì)胞生成；術(shù)后6月，脫細(xì)胞組腱骨間隙幾乎消失，Sharpey纖維大量生成排列有序，軟骨細(xì)胞成熟分化，而對(duì)照組腱骨間隙減小但存在，Sharpey纖維及軟骨細(xì)胞生成較前增多，但無(wú)明顯成熟分化趨勢(shì)。重建的ACL，術(shù)

12、后1月，脫細(xì)胞組可見(jiàn)少量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，而對(duì)照組存在大量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)；術(shù)后3月，脫細(xì)胞組膠原纖維排列有序，可見(jiàn)成纖維細(xì)胞及軟骨細(xì)胞增生，而對(duì)照組膠原纖維松散，可見(jiàn)少量成纖維細(xì)胞，未見(jiàn)軟骨細(xì)胞；術(shù)后6月，脫細(xì)胞組軟骨細(xì)胞大量增生并出現(xiàn)成熟分化，膠原纖維排列緊密、有序，而對(duì)照組膠原結(jié)構(gòu)仍較松散，成纖維細(xì)胞及軟骨細(xì)胞數(shù)量較少。術(shù)后3、6月的生物力學(xué)測(cè)試，ACL重建的抗拔出試驗(yàn)中，脫細(xì)胞組在彈性模量、最大載荷等指標(biāo)均優(yōu)于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

13、。
　　 四、結(jié)論：
　　 (一)、TBP法能有效去除同種異體肌腱內(nèi)部的細(xì)胞成分，去除免疫原性的同時(shí)對(duì)肌腱原有的生物學(xué)活性及力學(xué)特性無(wú)明顯影響。
　　 (二)、CT平掃能較好地重現(xiàn)膝關(guān)節(jié)重建ACL的影像。脫細(xì)胞肌腱復(fù)合rh-BMP-2重建兔ACL后，CT平掃發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，術(shù)后3、6月未見(jiàn)骨隧道增寬跡象，腱-骨界面存在成骨反應(yīng)。
　　 (三)、脫細(xì)胞肌腱復(fù)合rh-BMP-2重建兔ACL后，與對(duì)照組相比