可溶性腫瘤壞死因子受體Ⅱ-脂聯(lián)素球部融合蛋白的真核表達(dá)研究.pdf

1、目的：
　　 構(gòu)建一種人腫瘤壞死因子受體Ⅱ胞外區(qū)與人脂聯(lián)素球部的融合基因sTNFRⅡ-gAD,且相應(yīng)的融合蛋白在哺乳動(dòng)物BHK-21S細(xì)胞的無血清培養(yǎng)體系中實(shí)現(xiàn)表達(dá),對(duì)該融合蛋白進(jìn)行了初步鑒定,并且進(jìn)一步對(duì)sTNFRⅡ-gAD融合蛋白的大量制備進(jìn)行初步探索。
　　 方法：
　　 用RT-PCR方法從人的外周血淋巴細(xì)胞總RNA中擴(kuò)增人腫瘤壞死因子Ⅱ型受體胞外區(qū)基因片段,與脂聯(lián)素球部基因片段融合,克隆至pAAV2ne

2、o表達(dá)載體中,構(gòu)建成pAAV2neo-sTNFRⅡ-gAD,同時(shí)構(gòu)建對(duì)照質(zhì)粒pAAV2neo-Gluc-gAD。隨后,用pAAV2neo-sTNFRⅡ-gAD和pAAV2neo-Gluc-gAD轉(zhuǎn)染BHK-21S細(xì)胞獲得G418抗性細(xì)胞BHK-21S/pAAV2neo-sTNFRⅡ-gAD和BHK-21S/pAAV2neo-Gluc-gAD；然后,將原來含有血清的培養(yǎng)液換成無血清的化學(xué)成分限定的培養(yǎng)液,細(xì)胞從貼壁培養(yǎng)方式轉(zhuǎn)換成懸浮培養(yǎng)方

3、式；最后,收獲BHK-21S/pAAV2neo-sTNFRⅡ-gAD和BHK-21S/pAAV2neo-Gluc-gAD無血清懸浮培養(yǎng)24h后的培養(yǎng)上清,進(jìn)行sTNFRⅡ-gAD融合蛋白的鑒定分析。此外,為便于后續(xù)大規(guī)模生產(chǎn)及對(duì)sTNFRⅡ-gAD蛋白的特性研究,采用有限稀釋法篩選BHK-21S/pAAV2neo-sTNFRⅡ-gAD混合細(xì)胞株,獲得高表達(dá)sTNFRⅡ-gAD蛋白的單克隆細(xì)胞株,并對(duì)此細(xì)胞株進(jìn)行大規(guī)模無血清轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng),對(duì)培

4、養(yǎng)收獲的上清進(jìn)行硫酸銨沉淀濃縮獲得sTNFRⅡ-gAD蛋白粗制品。
　　 結(jié)果：
　　 (1)構(gòu)建獲得了pAAV2neo-sTNFRⅡ-gAD和pAAV2neo-Gluc-gAD兩種質(zhì)粒,酶切與測(cè)序顯示正確。
　　 (2)用抗人腫瘤壞死因子受體Ⅱ和抗人脂聯(lián)素球部的單克隆抗體分別檢測(cè)pAAV2neo-sTNFRⅡ-gAD瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的BHK-21S細(xì)胞,免疫熒光呈現(xiàn)陽性。
　　 用抗人脂聯(lián)素球部的單克隆抗體檢測(cè)

5、pAAV2neo-Gluc-gAD瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的BHK-21S細(xì)胞,免疫熒光呈現(xiàn)陽性,而用抗人腫瘤壞死因子受體Ⅱ檢測(cè)呈現(xiàn)陰性。
　　 (3)pAAV2neo-Gluc-gAD質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染BHK-21S細(xì)胞24h后上清中的Gluc有較高表達(dá)。
　　 (4)免疫印跡分析用抗人腫瘤壞死因子受體Ⅱ和抗人脂聯(lián)素球部的單克隆抗體檢測(cè)在pAAV2neo-sTNFRⅡ-gAD穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的BHK-21S細(xì)胞上清中檢測(cè)到sTNFRⅡ-gAD融合蛋

6、白的表達(dá),并以單體、三聚體和三聚體以上的多聚體形式存在。
　　 免疫印跡分析用抗人脂聯(lián)素球部的單克隆抗體檢測(cè)在pAAV2neo-Gluc-gAD穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的BHK-21S細(xì)胞上清檢測(cè)到Gluc-gAD融合蛋白的表達(dá)。
　　 (5)上清中sTNFRⅡ-gAD融合蛋白具有顯著抑制TNFα殺傷L929細(xì)胞的活性,而對(duì)照Gluc-gAD蛋白不具備此活性。
　　 (6)有限稀釋法篩選獲得相對(duì)高表達(dá)sTNFRⅡ-gAD蛋白的B

7、HK-21S/pAAV2neo-sTNFRⅡ-gAD細(xì)胞克隆株,命名為3號(hào)克隆。
　　 (7)探索獲得了一種快速檢測(cè)上清中sTNFRⅡ-gAD蛋白表達(dá)的方法:點(diǎn)雜交。
　　 (8)可采用硫酸銨方法對(duì)上清中sTNFRⅡ-gAD融合蛋白進(jìn)行濃縮。
　　 結(jié)論：
　　 成功構(gòu)建了pAAV2neo-sTNFRⅡ-gAD和對(duì)照質(zhì)粒pAAV2neo-Gluc-gAD,兩種質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染BHK-21S細(xì)胞后相應(yīng)的蛋白在上