抗除草劑轉(zhuǎn)基因甘薯的再生及鑒定.pdf

1、本研究以甘薯品種徐薯18的胚性懸浮細(xì)胞團(tuán)為受體材料，對根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的甘薯遺傳轉(zhuǎn)化體系進(jìn)行了優(yōu)化。同時利剛農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將bar基因?qū)肫贩N栗子香和徐薯18中，獲得了對除草劑具有高度抗性的轉(zhuǎn)基因植株；并且用bar基因作為篩選標(biāo)記基因，將SOS基因?qū)肜踝酉愫托焓?8中。主要結(jié)果如下： 1.將質(zhì)粒pBI121的gusA基因的酶切片段插入質(zhì)粒pCAMBIA3300的多克隆位點(diǎn)，構(gòu)建新的雙元載體pCAMBIA3300/GUS，并將其導(dǎo)入

2、農(nóng)桿菌菌株EHA105中。以徐薯18的胚性懸浮細(xì)胞為材料，對轉(zhuǎn)化體系進(jìn)行了優(yōu)化。利用GUS瞬時表達(dá)比較了甘露醇預(yù)處理及不同共培養(yǎng)方式對轉(zhuǎn)化效果的影響，結(jié)果表明，在共培養(yǎng)培養(yǎng)基中添加30mg/L，乙酰丁香酮時，非甘露醇預(yù)處理、液體靜置共培養(yǎng)的胚性細(xì)胞團(tuán)的Gus瞬時表達(dá)率最高，液體靜置共培養(yǎng)適宜的共培養(yǎng)時間為2 d。 2.對栗子香和徐薯18胚性細(xì)胞團(tuán)對PPT的敏感性進(jìn)行了分析，結(jié)果表明選擇培養(yǎng)基中適宜的PPT濃度分別為0.5 mg/

3、L和0.3m/L。用根癌農(nóng)桿菌菌株EHA105，分別轉(zhuǎn)化870個栗子香的胚性細(xì)胞團(tuán)和480個徐薯18的胚性細(xì)胞團(tuán)，通過選擇培養(yǎng)，分別獲得了165個和81個PPT抗性愈傷組織。其中的139個和62個抗性愈傷組織通過體細(xì)胞胚胎發(fā)生途徑，分別再生出1431株和276株擬轉(zhuǎn)基因植株。GUS檢測以及PCR、Southern blot和Northern blot分析表明，外源基因已經(jīng)整合到甘薯品種的基因組中；栗子香再生植株中轉(zhuǎn)基因植株占擬轉(zhuǎn)基因植株

4、的86％，徐薯18的再生植株中75％為轉(zhuǎn)基因植株。除草劑噴灑實(shí)驗(yàn)表明，轉(zhuǎn)基因植株對正常大田劑量甚至更高劑量的除草劑表現(xiàn)出很強(qiáng)的抗性，說明bar基因在轉(zhuǎn)基因植株中得到了有效的表達(dá)。未發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株在形態(tài)學(xué)上的變異。將抗除草劑的bar基因?qū)氲礁适砥贩N中，不僅可以獲得抗除草劑的轉(zhuǎn)基因甘薯，而且bar基因也可作為一種選擇標(biāo)記基因，為用基因工程改良甘薯提供一種有效手段。 3．以bar基因?yàn)檫x擇標(biāo)記基因，用攜帶雙元載體pCAMBIA330