絲裂霉素對體外培養(yǎng)人正常皮膚成纖維細胞及Hacat細胞的作用及機制研究.pdf

1、目的：探討不同濃度的絲裂霉素對體外培養(yǎng)的人正常皮膚成纖維細胞及HaCat細胞形態(tài)、細胞增殖、生長特性及細胞凋亡等方面的影響，從而選取適當?shù)淖饔脻舛龋芯吭摑舛鹊慕z裂霉素作用于皮膚成纖維細胞后，細胞內(nèi)caspase-3和caspase-8的表達，初步探討絲裂霉素的凋亡誘導機制，以及成纖維細胞內(nèi)細胞因子TGF-β1、bFGF與I、Ⅲ型前膠原蛋白mRNA的表達變化，為局部應(yīng)用絲裂霉素預防和治療耳鼻咽喉術(shù)后皮膚纖維增生及瘢痕形成提供理論依據(jù)。

2、 方法：體外培養(yǎng)人正常皮膚成纖維細胞及HaCat細胞。以O(shè).04mg/ml、0.4mg/ml濃度的絲裂霉素及無血清培養(yǎng)基對照分別作用于這兩種細胞5min，培養(yǎng)不同時程后采用倒置顯微鏡、細胞計數(shù)及MTT檢測法觀察兩種細胞形態(tài)、增殖、生長特性與增殖抑制情況；采用AO/PI染色觀察計數(shù)成纖維細胞的凋亡率；通過western blot法檢測caspase-3的表達，免疫熒光法檢測細胞內(nèi)caspase-8活化及TGF-β1的表達RT-PCR

3、法檢測細胞內(nèi)TGF-β1、bFGF、I型及川型前膠原蛋白mRNA的表達情況。采用IPP圖像分析軟件和spssv15.0統(tǒng)計軟件進行圖片分析與統(tǒng)計學處理。 結(jié)果：正常生長的成纖維細胞及HaCat細胞呈指數(shù)生長；0.04mg/ml及0.4mg/ml濃度的絲裂霉素作用5min后能有效抑制皮膚成纖維細胞及HaCat細胞的增殖，并使細胞增大變形、細胞間形態(tài)差異較大。0.04mg/ml濃度的絲裂霉素作用后第5天成纖維細胞呈現(xiàn)小幅增殖，對成纖

4、維細胞的抑制強度明顯低于0.4mg/ml濃度的絲裂霉素；兩種試驗濃度的絲裂霉素所致成纖維細胞的死亡形式主要為凋亡，0.4mg/ml濃度的絲裂霉素促凋亡作用明顯強于0.04mg/ml濃度的絲裂霉素，兩者比較差異有統(tǒng)計學意義(p<0.05)。0.4mg/ml濃度的絲裂霉素作用后前caspase-3表達先升高后降低，免疫熒光法檢測到隨培養(yǎng)時間的延長caspase-8活化片段的熒光強度逐漸增強，提示caspase-8的活化增多；0.4mg/ml

5、濃度的絲裂霉素作用后，免疫熒光法檢測細胞內(nèi)TGF-β1蛋白表達變化不明顯，但細胞內(nèi)TGF-β1 mRNA卻隨培養(yǎng)時間的延長表達逐漸減少，bFGF mRNA的表達逐漸增高，I型、Ⅲ型前膠原蛋白mRNA的表達量則明顯下降。 結(jié)論：0.04mg/ml和0.4mg/ml濃度的絲裂霉素能有效的抑制人皮膚成纖維細胞增殖，以0.4mg/ml濃度的絲裂霉素抑制作用較持久；絲裂霉素可以通過啟動caspase凋亡途徑，增加細胞凋亡；實驗濃度的絲裂霉