調(diào)節(jié)性γδT細胞的體外誘導及體外擴增的γδT細胞趨化機理的初步研究.pdf

1、第一部分小鼠調(diào)節(jié)性γδT細胞的初步研究
　　 調(diào)節(jié)性T細胞(Regulatory T cells, Tregs)是T細胞的一個亞群，能通過影響其它免疫細胞的活性來發(fā)揮抑制免疫應答的功能。近年來，調(diào)節(jié)性T細胞成為免疫學領域的一個研究熱點:經(jīng)典的CD4+CD25+ TCRaβTreg的功能己經(jīng)基本明了，CD4+CD25" T細胞在體外經(jīng)過anti-TCR/CD3e的刺激和TGF-β的誘導可以轉(zhuǎn)變?yōu)镃D4+CD25+Treg,并且高表

2、達Treg的特異性標記物Foxp3。γδT細胞雖然只占總T細胞的一小部分，但其獨特的抗原識別模式使得γδT細胞在免疫系統(tǒng)中發(fā)揮著重要的作用。近年來，許多研究結果表明γδT細胞具有免疫調(diào)節(jié)功能。我們感興趣的是小鼠的γδT細胞是否也具有免疫調(diào)節(jié)表型的亞群，以及是否可以在體外經(jīng)過anti-TCR的刺激和TGF-β的誘導而產(chǎn)生具有免疫調(diào)節(jié)功能的γδT細胞。我們以小鼠脾臟的T細胞為研究體系，利用流式染色和RT-PCR方法檢測γδT細胞Foxp3的

3、表達情況。結果顯示，新鮮分離的小鼠脾臟γδT細胞并不表達Foxp3。然而，當脾臟T細胞在固相化anti-TCRyβ抗體刺激下培養(yǎng)，并添加TGF-β(濃度為5ng/ml)誘導5-8天后，Realtime PCR和免疫熒光染色結果顯示，TGF-β誘導組的γδT細胞出現(xiàn)Foxp3的表達，與CD25表達相一致，而未誘導組的γδT細胞基本無Foxp3的表達。此外，相對于誘導組的TCRγδ+CD25" T細胞，誘導組的TCRγδ+CD25+T細胞不

4、僅表達Foxp3，還高表達免疫調(diào)節(jié)相關分子TGF-β和GITR。隨后，我們通過體外功能實驗證明誘導組的γδT細胞能夠明顯抑制anti-CD3抗體對初始T細胞的活化和增殖作用。綜上所述，小鼠γδT細胞在經(jīng)過固相化anti-TCRyβ刺激和TGF-β誘導后可以產(chǎn)生具有免疫調(diào)節(jié)表型和功能的細胞。
　　 第二部分腫瘤過繼免疫治療中γδT細胞趨化機理的初步研究
　　γδT細胞是一類不同于αβT細胞的特殊細胞。近年的研究表明,無論是

5、體內(nèi)還是體外,活化的γδT細胞都具有很強的殺傷各種實體腫瘤和血液腫瘤的活性。因此γδT細胞被認為是用于腫瘤過繼免疫治療很有前景的細胞。然而γδT細胞在體內(nèi)是否能夠有效分布于腫瘤組織是其發(fā)揮抗腫瘤作用的前提。本實驗室建立了一套固相化anti-TCRγδ抗體體外擴增培養(yǎng)γδT細胞的方法,所獲γδT細胞制劑在體外具有很強的殺傷腫瘤細胞的活性。為了考察γδT細胞制劑在體內(nèi),特別是腫瘤組織的分布規(guī)律,我們首先分析了培養(yǎng)后γδT細胞表面趨化因子受體

6、的表達情況,隨后以結直腸癌為研究對象,分析了結直腸癌細胞系和結直腸癌組織標本中趨化因子的表達情況,最后利用趨化實驗和趨化封閉實驗考察了結直腸癌組織對γδT細胞的趨化作用。γδT細胞制劑制備于固相化抗體體外擴增的人外周血單個核細胞,γδT細胞在擴增前后趨化因子受體的表達情況采用免疫熒光染色和流式細胞術進行分析。結果顯示CCR5和CXCR3是體外擴增的Vδ1T細胞和Vδ2T細胞表面主要的趨化因子受體。用RT-PCR法檢測4種人結直腸癌細胞系

7、和10例人結直腸癌組織標本(每例均包括腫瘤組織和瘤旁組織)趨化因子的表達情況。結果表明,不同的人結直腸癌細胞系能夠表達不同的趨化因子；人結直腸癌組織標本中腫瘤組織和瘤旁組織也存在多種趨化因子的表達,其中均包括CCR5和CXCR3的配體分子。因此,我們以兩種結腸癌細胞系(HT-29和HR8348)為代表,進行了腫瘤細胞對γδT細胞的趨化實驗,并利用CCR5和CXCR3封閉抗體考察了兩種趨化因子受體在γδT細胞趨化作用中的貢獻。結果顯示經(jīng)過