Ghrelin對(duì)地塞米松誘導(dǎo)胰島細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用的研究.pdf

1、前言：
　　 糖皮質(zhì)激素是下丘腦-垂體-腎上腺(hypothalamic-pituitary-adrenalHPA)軸的最終激素,是一種重要的胰島素拮抗激素。臨床上大量應(yīng)用糖皮質(zhì)激素會(huì)引起糖耐量異常、胰島素抵抗,甚至發(fā)展為類(lèi)固醇糖尿病(steroiddiabetesSD)。目前SD定義為內(nèi)源性皮質(zhì)醇增多或糖皮質(zhì)激素治療所致的繼發(fā)性糖尿病。國(guó)外研究認(rèn)為長(zhǎng)期使用糖皮質(zhì)激素的病人患糖尿病的風(fēng)險(xiǎn)度為1.5到2.5。
　　 目前的

2、研究認(rèn)為SD的發(fā)病機(jī)制包括:①通過(guò)骨骼肌途徑(影響糖脂代謝);②通過(guò)肝臟途徑(影響糖脂代謝);③降低胰島素的釋放;④引起胰島細(xì)胞凋亡:國(guó)內(nèi)外對(duì)此報(bào)道罕見(jiàn)。研究認(rèn)為糖皮質(zhì)激素可通過(guò)cAMP/PKA信號(hào)通路、PI3K/AKT信號(hào)通路、通過(guò)調(diào)節(jié)bcl-2/bax的比率及線粒體的去極化等途徑引起胰島細(xì)胞凋亡。而對(duì)于地塞米松是否可通過(guò)P38MAPK信號(hào)通路誘導(dǎo)胰島細(xì)胞凋亡和胰島細(xì)胞保護(hù)劑Ghrelin對(duì)地塞米松誘導(dǎo)胰島細(xì)胞凋亡是否具有保護(hù)作用及與

3、P38MAPK信號(hào)通路的關(guān)系國(guó)內(nèi)外未見(jiàn)報(bào)道。
　　 故本研究采用不同濃度不同時(shí)間Ghrelin作用于地塞米松誘導(dǎo)的胰島細(xì)胞后檢測(cè)細(xì)胞凋亡水平的變化,同時(shí)檢測(cè)地塞米松誘導(dǎo)胰島細(xì)胞凋亡是否可通過(guò)P38MAPK信號(hào)通路及此信號(hào)通路是否參與Ghrelin對(duì)胰島細(xì)胞凋亡保護(hù)作用。從而為糖皮質(zhì)激素對(duì)胰島細(xì)胞毒性作用的保護(hù)及類(lèi)固醇性糖尿病的防治提供可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 材料與方法：
　　 一、實(shí)驗(yàn)材料
　　 大鼠胰島

4、細(xì)胞株INS-1(10-30代);Ghrelin,地塞米松,SB203580(P38MAPK信號(hào)通路阻斷劑);Phospho-P38MAPK抗體;MTS凋亡檢測(cè)試劑盒,Annexin-V-FITC-PI雙染試劑盒。
　　 二、實(shí)驗(yàn)方法
　　 1、細(xì)胞培養(yǎng)
　　 大鼠胰島細(xì)胞株INS-1在RPMI1640培養(yǎng)基和10%胎牛血清中于37℃、5%CO2條件下進(jìn)行培養(yǎng)。細(xì)胞單層生長(zhǎng)達(dá)80-85%培養(yǎng)面積后,用于實(shí)驗(yàn)或細(xì)胞

5、傳代。
　　 2、MTS凋亡檢測(cè)
　　 收集對(duì)數(shù)期細(xì)胞,以96孔板中不同濃度INS-1細(xì)胞接種數(shù),觀察作用3-4天確定最佳的細(xì)胞接種濃度。上述方法確定的最佳細(xì)胞接種濃度為1×104-4×104/孔,每孔中加入1×104個(gè)細(xì)胞,達(dá)到作用時(shí)間后,每孔中加入MTS試劑10ul,37℃孵育,1-4h內(nèi)在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀490nm波長(zhǎng)測(cè)定各孔OD值。每份標(biāo)本均檢測(cè)3個(gè)復(fù)孔。
　　 3、AnnexinV-PI雙染,流式細(xì)胞儀分

6、析
　　 收集細(xì)胞,用PBS洗滌并取1×105個(gè)細(xì)胞,離心后棄上清,加入300ul緩沖液懸浮細(xì)胞。加入5ulAnnexinV-FITC混勻后,加入5ulPI混勻。室溫、避光、反應(yīng)5～15min。1小時(shí)內(nèi)流式細(xì)胞儀檢測(cè)。每份標(biāo)本均檢測(cè)3個(gè)復(fù)孔。
　　 4、WesternBlot(免疫印記)
　　 應(yīng)用細(xì)胞裂解液提取細(xì)胞蛋白,測(cè)定蛋白濃度。制備10%聚丙烯酰胺凝膠,進(jìn)行電泳,轉(zhuǎn)膜,雜交。磷酸化P38MAPK上樣量為1

7、00ug。ECL發(fā)光法測(cè)定目的條帶,目的條帶的灰度值用ScionImage軟件分析。每份標(biāo)本均檢測(cè)3個(gè)復(fù)孔。
　　 5、流式細(xì)胞儀檢測(cè)Phospho-P38MAPK含量
　　 收集細(xì)胞,使用甲醛溶液固定,甲醇穿孔,然后取5×105個(gè)細(xì)胞,離心棄上清,加入一抗孵育,離心棄上清,加入二抗孵育,離心棄上清,加入500ulPBS重懸,流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測(cè)。每份標(biāo)本均檢測(cè)3個(gè)復(fù)孔。結(jié)果采用WinMDI2.9軟件分析。
　　

8、6、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　 采用SPSS19.0軟件進(jìn)行單因素方差(ANOVA)統(tǒng)計(jì)分析,結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差,組間差異比較采用Dunnett's檢驗(yàn),P＜0.05差異有顯著性。
　　 研究結(jié)果：
　　 一、Ghrelin對(duì)地塞米松誘導(dǎo)大鼠胰島β細(xì)胞凋亡的影響
　　 流式細(xì)胞儀檢測(cè)AnnexinV-PI雙染細(xì)胞分析與MTS檢測(cè)結(jié)果相似。即胰島細(xì)胞凋亡率在加入lnMGhrelin(43.53%)時(shí)與DEX組(46.

9、70%)無(wú)明顯差異(P＞0.05),從10nMGhrelin(27.95%)開(kāi)始胰島細(xì)胞凋亡率明顯下降,在Ghrelin為100nM(9.05%)時(shí)胰島細(xì)胞凋亡率最低與空白對(duì)照組(8.17%)無(wú)明顯差異。
　　 二、Phospho-P38MAPK表達(dá)與Ghrelin拮抗地塞米松誘導(dǎo)胰島細(xì)胞凋亡的關(guān)系
　　 流式細(xì)胞儀及WesternBlot檢測(cè)結(jié)果:Phospho-p38MAPK含量DEX組明顯高于對(duì)照組及SB組、DEX

10、+SB組及DEX+Ghrelin組。同時(shí)SB組、DEX+SB組及DEX+Ghrelin組Phospho-p38MAPK蛋白水平表達(dá)基本相當(dāng)。
　　 三、P38MAPK信號(hào)通路對(duì)Ghrelin拮抗地塞米松誘導(dǎo)胰島細(xì)胞凋亡率的影響
　　 MTS及流式細(xì)胞儀檢測(cè)胰島細(xì)胞凋亡率結(jié)果:DEX組較對(duì)照組胰島細(xì)胞凋亡率明顯增加;SB組細(xì)胞凋亡率與對(duì)照組無(wú)明顯差別,而凋亡率明顯低于DEX組:DEX+SB組較DEX組細(xì)胞凋亡率下降但仍高于