過(guò)氧化氫誘導(dǎo)斜帶石斑魚(yú)肝細(xì)胞氧化損傷的轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究.pdf

1、1.H2O2誘導(dǎo)斜帶石斑魚(yú)肝細(xì)胞氧化損傷模型的建立
　　通過(guò)不同的過(guò)氧化氫培養(yǎng)濃度(0、100、200、400、600、800、1000μmol/L)和作用時(shí)間(2、4、6、8、12、24h)探索適宜的斜帶石斑魚(yú)肝細(xì)胞氧化損傷濃度和時(shí)間，以建立的斜帶石斑魚(yú)原代肝細(xì)胞氧化損傷模型，并檢測(cè)培養(yǎng)過(guò)程中肝細(xì)胞的數(shù)量和活性的變化。采用單因子完全隨機(jī)設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，根據(jù)臺(tái)盼藍(lán)對(duì)死細(xì)胞拒染法利用血球計(jì)數(shù)板測(cè)定細(xì)胞活力及數(shù)量，并通過(guò)MTT法測(cè)定細(xì)胞存活

2、率。結(jié)果顯示，800μmol/L H2O2，作用8h，斜帶石斑魚(yú)肝細(xì)胞的存活率降低至61.98％。
　　2.H2O2對(duì)斜帶石斑魚(yú)原代肝細(xì)胞活性及功能的影響
　　本研究采用斜帶石斑魚(yú)原代肝細(xì)胞模型，主要探究過(guò)氧化氫對(duì)原代培養(yǎng)的肝細(xì)胞氧化損傷機(jī)制的影響。通過(guò)測(cè)定不同培養(yǎng)時(shí)間下過(guò)氧化氫不同作用濃度的肝細(xì)胞或培養(yǎng)上清液中的超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、脂質(zhì)過(guò)氧化物(LPO)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-PX)、過(guò)氧化氫

3、酶(CAT)的變化，分析細(xì)胞生長(zhǎng)代謝狀態(tài)。結(jié)果顯示，使用過(guò)氧化氫處理后其他各組與800μmol/L和1000μmol/L組相比顯著降低了CAT、GSH-PX和SOD活性，顯著升高LPO、MDA含量(P＜0.05），但是800和1000μmol/L組之間沒(méi)有顯著差異(P＞0.05)。結(jié)果發(fā)現(xiàn):H2O2過(guò)氧化氫作用時(shí)間為8h、作用濃度為800μmol/L，使斜帶石斑魚(yú)原代肝細(xì)胞產(chǎn)生了明顯的氧化應(yīng)激，該條件可作為建立斜帶石斑魚(yú)肝細(xì)胞氧化損傷模

4、型的適宜條件。
　　3.利用轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)研究過(guò)氧化氫對(duì)肝細(xì)胞差異表達(dá)影響
　　本研究以過(guò)氧化氫為刺激源誘導(dǎo)建立了斜帶石斑魚(yú)肝細(xì)胞氧化損傷模型，試驗(yàn)基于RNA-Seq技術(shù)對(duì)正常處理組(L-15)和對(duì)照組(800μmol/L H2O2)的斜帶石斑魚(yú)肝細(xì)胞進(jìn)行測(cè)序，利用轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)深度分析細(xì)胞內(nèi)部基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控以及過(guò)氧化氫處理后細(xì)胞表型和功能的改變。結(jié)果顯示，通過(guò)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，對(duì)83，802，103條原始reads的篩選和排

5、除，拼接獲得到了112，618條Unigenes，平均長(zhǎng)度為957.45bp，N50為1，687bp。按照Blast等相關(guān)軟件，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)分析后，共得到功能注釋基因110，560個(gè)。依據(jù)GO富集分析發(fā)現(xiàn)，差異表達(dá)基因主要被集中在代謝通路、細(xì)胞過(guò)程、生物調(diào)控等通路中，在KEGGpathway富集分析中結(jié)果顯示，代謝通路涉及基因最多，有170個(gè)。兩種水平下（過(guò)氧化氫處理組和對(duì)照組）共差異表達(dá)的基因共2，570個(gè)，其中上調(diào)的基因1，520